PreS-Tat真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、背景和目的:
　　 乙型肝炎病毒(HBV)感染已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅全人類健康的主要問(wèn)題之一。據(jù)估計(jì),全球大約有3.5億HBV攜帶者,每年約有100萬(wàn)人死于由于乙肝病毒感染所致的肝細(xì)胞癌、肝硬化、肝衰竭等相關(guān)疾病。我國(guó)是HBV感染嚴(yán)重的地區(qū),據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國(guó)的慢性無(wú)癥狀HBV攜帶者(AsC)可能超過(guò)1.3億人,約占全球HBV病毒攜帶者的1／3,基本占我國(guó)人口總數(shù)的10％。HBV病毒感染與發(fā)病率在國(guó)內(nèi)一直位于前列。
　　 HB

2、V結(jié)構(gòu)獨(dú)特,是目前已知的感染人類最小的DNA病毒。它由兩條長(zhǎng)度不同的鏈組成一個(gè)小雙環(huán)的雙鏈DNA。HBV復(fù)制率高,具有很強(qiáng)的適應(yīng)性與變異性。HBV復(fù)制有逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程,而參與逆轉(zhuǎn)錄的DNA聚合酶缺乏校對(duì)作用,因此,HBVDNA容易產(chǎn)生不可修復(fù)的變異。病毒的變異為疾病的預(yù)防、診斷、治療等帶來(lái)困難與挑戰(zhàn)。體內(nèi)HBV感染缺乏自發(fā)性的病毒清除機(jī)制,目前最有效的方法是采用抗病毒藥物進(jìn)行抗病毒治療,然而由于作用靶點(diǎn)的限制等因素,沒(méi)有一種藥物能夠完全清

3、除體內(nèi)的HBV。慢性肝炎逐漸按照炎癥壞死、纖維化和肝硬化的程序發(fā)展,最終又發(fā)展為肝衰竭和肝細(xì)胞癌,為家庭與社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。尋找新的治療乙肝的藥物是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建pEGFP—PreS—Tat嵌合載體并在Hela細(xì)胞中表達(dá),為下一步研究該蛋白肝細(xì)胞特異性靶向藥物的研究打下基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 通過(guò)基因克隆技術(shù)從臨床上確診的乙肝病毒感染陽(yáng)性的患者的血清中擴(kuò)增出PreS序列,然后定向克隆入pEGF

4、P—C3載體,將人工合成的Tat序列連接到PreS序列下游,構(gòu)建pEGFP—Pres—Tat嵌合載體。連接成功后的載體轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞,采用Western Blot法檢測(cè)表達(dá)的蛋白。
　　 結(jié)果:
　　 經(jīng)過(guò)雙酶切及測(cè)序,構(gòu)建成功pEGFP—PreS—Tat嵌合載體,Western Blot檢測(cè)到該載體能夠表達(dá)相應(yīng)的蛋白。
　　 結(jié)論:
　　 成功的構(gòu)建了pEGFP—PreS—Tat嵌合載體,為下一步研究該