人生長激素真核表達載體的構(gòu)建及其瞬時表達.pdf

1、目的 人生長激素(humangrowthhormone，hGH)是由人腦垂體前葉分泌的一種多肽，可促進生長發(fā)育與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝及免疫功能，對機體的各個器官和各種組織均有影響，尤其對骨骼、肌肉及內(nèi)臟器官的作用更為顯著[1】。hGH基因位于第17號染色體長臂【2]，包括5個外顯子和4個內(nèi)含子以及3’末端、5’末端的不翻譯序列，跨度為26kb。人生長激素是由hGH基因先翻譯為激素原，然后經(jīng)酶解將217個氨基酸的前生長素切去26個氨基酸的

2、前肽轉(zhuǎn)變而成[3，4】。人生長激素是一條單鏈，含有191個氨基酸的親水性球蛋白，分子量為21．7KDa[1,3,5,6,7]。 最近研究發(fā)現(xiàn)，生長激素缺乏癥遠比我們過去認為的更加普遍[8】。成人生長激素缺乏癥是一種非常獨特的疾病，它對心血管危險因子有一定的影響(如引起高脂血癥、降低纖維蛋白溶解作用、發(fā)生動脈粥樣硬化的概率增加)，使心臟的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常改變，增加了,~lfil．管疾病的罹患率，并可使機體發(fā)生畸形構(gòu)建(降低機體肌

3、肉量、增加脂肪含量、使細胞外水分減少)，身體活動能力下降，損害骨骼的強度，區(qū)域性骨礦物質(zhì)密度下降[9]；兒童生長激素缺乏還可以導(dǎo)致侏儒癥[10】?？傊L激素缺乏是一種危害人類健康的不可小覷的疾病。 研究證明牛生長激素對人類無效，而從尸體中獲得的人生長激素的量少且用于臨床治療時可使Creutzfeldt-Jacob病的患病率增高…，[11,12】，自從運用重組DNA技術(shù)將人生長激素基因在大腸埃希菌中表達以來【13】，重組人生長

4、激素在臨床中就有著廣泛的應(yīng)用。對生長激素缺乏癥的兒童來說，用重組人生長激素進行替代治療效果顯著，其可以使患者成年終身FAH高最接近遺傳靶身高【14】；在治療成人生長激素缺乏癥能夠逆轉(zhuǎn)典型的代謝和改變機體成分(如它能明顯提高肌肉量，腰椎及骨礦物質(zhì)密度和載脂蛋白A1濃度，從而是脂肪含量下降，胰島素耐受性降低)㈣。在非生長激素缺乏癥的矮身材中運用重組人生長激素亦有積極作用。此外，重組人生長激素在心肌病，肝硬化，慢性腎功能衰竭、感染性疾病、燒傷

5、和艾滋病患者消耗期中都起重要作用[16-26]。 本研究中將克隆的人生長激素插入到含有綠色熒光蛋白基因的真核表達載體pcDNA3．1(pcGFP)中，構(gòu)建真核質(zhì)粒pcGFP-GH。構(gòu)建成功的pcGFP-GH表達載體通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染成纖維細胞系，以原位雜交技術(shù)和熒光顯微鏡檢測人生長激素和綠色熒光蛋白在成纖維細胞中的瞬時表達。 材料和方法： 1．載體pcGFP-GH的構(gòu)建：

6、以含hGH的質(zhì)粒Wap2hGH為模板，設(shè)計引物(上下游引物分別有HindlII和BamHI酶切位點)，PCR擴增hGH的DNA片段，以HindIII和BamHI對擴增產(chǎn)物進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收1．5kb酶切片段。以HindlII和BamHI雙酶切質(zhì)粒pcGFP，瓊脂糖凝膠電泳回收6．8kb酶切片段。HindIII和BamHI粘性末端互補。以T4連接酶連接1．5kbhGH的目的片段和6．8kbpeGFP質(zhì)粒DNA片段，16~C，連

7、接過夜。重組體轉(zhuǎn)化感受態(tài)TGI細菌。將轉(zhuǎn)化菌涂于含Amp的LB培養(yǎng)皿上，37~C，培養(yǎng)過夜。隨機挑選6個克隆，接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中，37~C，振蕩培養(yǎng)過夜。小提質(zhì)粒，分別進行HindIII單酶切，Bam_HI單酶切以及HindIII和BamHI雙酶切鑒定。構(gòu)建成功的載體命名為pcGFP-GH一 2．載體pcGFP-GH的瞬時表達鑒定：以隨機引物法地高辛標記hGHDNA探針，一20~C保存。將表達載體pcGFP-GH與脂質(zhì)

8、轉(zhuǎn)染胺試劑LipofectamineTM2000混合轉(zhuǎn)染NIH一3T3細胞，培養(yǎng)36小時后，在熒光顯微鏡下觀察，收集細胞，制備細胞滴片，一20~C保存。采用原位雜交技術(shù)，以地高辛標記hGHDNA探針檢測hGH在細胞滴片上的表達。 結(jié)果： 1陽性重組質(zhì)粒pcGFP-GH單酶切，瓊脂糖電泳顯示為8．3kb條帶；HindlII和BamHI雙酶切，顯示為1．5kb和6．8kb條帶。 2脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑Lipofectami