凝血因子Ⅸ無義突變真核表達載體的構建、鑒定及其表達.pdf

1、研究目的：
　　 血友病B(hemophilia B，HB)是凝血因子Ⅸ(factorⅨ，F(xiàn)Ⅸ)基因缺陷引起血漿FⅨ含量或活性下降所導致的一種連鎖隱性遺傳性出血疾病，男性中發(fā)病率約為1/30000，嚴重危害人民健康。FⅨ基因缺陷具有明顯異質(zhì)性，其中無義突變是導致重型HB的重要原因之一。本研究旨在構建4種包含不同類型無義突變的FⅨ真核表達載體，為進一步研究無義突變引起FⅨ表達量降低的機制及其治療奠定基礎。
　　 方法：

2、r>　　 1.對血友病B突變數(shù)據(jù)庫進行分析，尋找FⅨ基因無義突變頻發(fā)位點。
　　 2.采用以PCR為基礎的定點突變法體外構建FⅨ基因無義突變真核表達載體，并通過DNA序列分析進一步鑒定證實。
　　 3.應用脂質(zhì)體轉化技術將野生型、突變型FⅨ表達載體分別瞬時轉染COS-7細胞，同時進行綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)共轉染，使用熒光顯微鏡觀察轉染效率。
　　 4.采用實時

3、定量PCR檢測不同位點無義突變對FⅨ基因mRNA表達水平的影響并進行統(tǒng)計學分析；采用Western blot方法檢測野生型及各突變型FⅨ基因蛋白的表達。
　　 結果：
　　 1.R29X、R116X、W194X、R333X4種FⅨ基因無義突變的病例數(shù)集中，發(fā)生頻率較高。
　　 2.DNA序列分析證明，構建的4個突變型質(zhì)粒除相應位點無義突變外，未見其它突變，提示無義突變載體構建成功。
　　 3.GFP共轉染

4、證實質(zhì)粒易于轉染COS-7細胞并能在其中表達。
　　 4.野生型及各突變組真核表達載體可轉染COS-7細胞株并能進行表達。各突變組FⅨ基因mRNA表達水平與野生型相比無統(tǒng)計學差別(P＞0.05)。
　　 結論：
　　 1.成功構建4種發(fā)生頻率高的FⅨ無義突變真核表達載體，并驗證了該表達載體可在COS-7細胞中進行表達。
　　 2.表達載體中的無義突變對FⅨ基因mRNA表達水平無影響，可能與實驗采用的FⅨ基