IL-24突變體真核表達載體的構(gòu)建及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的: 構(gòu)建IL-24突變體(RGD-IL-24)真核表達載體，對比研究RGD-IL-24和野生型IL-24對腫瘤細胞MCF-7，HeLa，Ketr-3及正常細胞NHLF的生長抑制作用并初步探討其機制，為進一步研究RGD-IL-24的體內(nèi)靶向抑瘤活性及其臨床應用奠定基礎(chǔ)。同時豐富了IL-24在腫瘤治療中的應用形式，為腫瘤靶向治療提供新思路。
　　 方法: 利用定位點突變技術(shù)，在IL-24基因序列精氨酸密碼子(AGA) 和天冬氨酸

2、密碼子(GAC)之間插入甘氨酸密碼子(GGT)，構(gòu)建含RGD膜序的IL-24突變體(RGD-IL-24)；將重組RGD-IL-24和IL-24分別插入真核表達載體pCDNA3.1，通過酶切、測序鑒定陽性重組質(zhì)粒；培養(yǎng)人乳腺癌細胞MCF-7、人宮頸癌細胞HeLa、人腎癌細胞Ketr-3和正常人肺成纖維細胞NHLF，分別用pCDNA3.1、pCDNA3.1/IL-24和pCDNA3.1/RGD-IL-24轉(zhuǎn)染四種細胞。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應

3、(RT-PCR) 檢測IL-24 mRNA表達；蛋白印跡 (Western blot) 檢測IL-24蛋白表達；MTT 檢測細胞增殖；FITC-annexin V染色檢測細胞早期凋亡；Hoechst33258染色檢測細胞晚期凋亡；Western blot檢測bax，bcl-2的表達和caspase 3的活性。
　　 結(jié)果:
　　 1. 成功構(gòu)建IL-24突變體(RGD-IL-24)，并插入真核表達載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCD

4、NA3.1/RGD-IL-24，測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒序列與理論序列完全吻合。
　　 2. RT-PCR檢測IL-24 mRNA表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24組均表達IL-24 mRNA，兩處理組mRNA表達量的差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 3. Western blot檢測IL-24蛋白表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3

5、.1/IL-24組均表達IL-24蛋白，兩處理組IL-24蛋白表達量的差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 4. MTT檢測細胞增殖情況，結(jié)果顯示：(1) pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24治療后三種腫瘤細胞株的增殖均受抑制，且這種抑制作用隨著時間的延長而增加；(2) pCDNA3.1/RGD-IL-24對腫瘤細胞的抑制作用與pCDNA3.1/IL-24組相比差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，

6、其對細胞的抑制作用明顯高于pCDNA3.1/IL-24組；(3) pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24對正常細胞NHLF無生長抑制作用。
　　 5. FITC-annexin V染色檢測細胞早期凋亡，結(jié)果顯示：與對照組相比，pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24治療后腫瘤細胞凋亡明顯，且pCDNA3.1/RGD-IL-24組早期凋亡細胞數(shù)多于pCDNA3.1/IL-24組

7、，兩組差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24對正常細胞無影響。
　　 6. Hoechst33258染色檢測細胞晚期凋亡，結(jié)果顯示：與對照組相比，pCDNA3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24治療后腫瘤細胞凋亡明顯，且pCDNA3.1/RGD-IL-24組凋亡細胞數(shù)多于pCDNA3.1/IL-24組，兩組差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；pCDNA

8、3.1/RGD-IL-24和pCDNA3.1/IL-24對正常細胞無影響。
　　 7. Western blot 檢測各組bax，bcl-2蛋白表達。就腫瘤細胞而言，bax/bcl-2的比值在pCDNA3.1/RGD-IL-24組和pCDNA3.1/IL-24組是增高的，且pCDNA3.1/RGD-IL-24組bax/bcl-2的比值增高更明顯。
　　 8. Western blot 檢測各組caspase 3的活化情況

9、。在腫瘤細胞中，pCDNA3.1/RGD-IL-24組和pCDNA3.1/IL-24組檢測到活化的caspase 3，且pCDNA3.1/RGD-IL-24組caspase 3活化量較多。
　　 結(jié)論: 成功構(gòu)建IL-24突變體RGD-IL-24，并插入pCDNA3.1，構(gòu)建IL-24突變體的真核表達載體；在IL-24 cDNA序列中插入甘氨酸密碼子GGT不影響IL-24 mRNA 和IL-24蛋白的表達；RGD-IL-24能高