含RGD肽IL-24突變體的構(gòu)建及其靶向抗腫瘤研究.pdf

1、目的：利用RGD 肽能特異性識別并結(jié)合腫瘤細胞表面整合素的特性，構(gòu)建含RGD肽的IL-24 突變體(RGD-IL-24)，使得IL-24 能靶向作用于腫瘤細胞。與IL-24 對照，研究RGD-IL-24 對4 種腫瘤細胞A549、HepG-2、HeLa、ACHN 及正常細胞NHLF 的生長抑制作用并初步探討其作用機制，為進一步研究RGD-IL-24 的體內(nèi)靶向抑瘤活性及其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。同時豐富了IL-24 在腫瘤治療中的應(yīng)用形式，為

2、腫瘤靶向治療提供了新思路。
　　 方法：
　　 1. 利用定點突變技術(shù)，在IL-24 的cDNA 序列中插入了甘氨酸密碼子GGC，使表達IL-24 蛋白的Arg-164 和Asp-165 殘基之間中插入Gly 殘基，從而構(gòu)建含RGD 肽模體的IL-24 突變體(RGD-IL-24)；將此重組的cDNA 插入表達質(zhì)粒pET28a(+)，獲得重組質(zhì)粒pET28a/RGD-IL-24，通過酶切、測序鑒定陽性重組質(zhì)粒。
　

3、　 2. 利用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株BL21(DE3) 進行蛋白表達，SDS-PAGE 電泳和Western Blotting 鑒定，確定目的蛋白的表達。通過重組工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得RGD-IL-24 包涵體。洗滌溶解后利用目的蛋白攜帶的6×His 純化標(biāo)簽，采用鎳離子親合層析純化蛋白RGD-IL-24。通過透析復(fù)性使目的蛋白正確折疊。
　　 3. 檢測RGD-IL-24 抗腫瘤活性，用RGD-IL-24 體外治療人肺癌細胞株A5

4、49、子宮頸癌細胞株HeLa、肝癌細胞株HepG2、腎癌細胞株ACHN 和正常人肺成纖維細胞株NHLF， MTT 檢測細胞的體外增殖；FITC-annexin V 染色檢測細胞早期凋亡；DAPI 染色檢測細胞晚期凋亡；western blot 檢測bax、bcl2 蛋白的表達和caspase3 的活化情況。
　　 4. RGD-IL-24 的免疫活性測定，應(yīng)用雙抗體夾心ELISA 法檢測RGD-IL-24刺激外周血單核細胞(PB

5、MC)產(chǎn)生IL-6、TNF-α和INF-γ的能力。
　　 5. 細胞粘附實驗和粘附抑制實驗檢測RGD-IL-24 在體外與腫瘤細胞的結(jié)合特性，鑒定RGD-IL-24 體外對腫瘤細胞的靶向特性。
　　 結(jié)果：
　　 1. 成功構(gòu)建了RGD-IL-24 的基因，并插入表達質(zhì)粒pET28a(+)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a/RGD-IL-24，DNA 測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒序列與理論序列完全吻合。
　　 2.

6、重組質(zhì)粒pET28a/RGD-IL-24 轉(zhuǎn)化表達菌株后，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，收獲菌體總蛋白，SDS-PAGE 電泳并考馬斯亮藍染色后，分析表達目的蛋白RGD-IL-24 約占菌體總蛋白的30.47％，且目的蛋白的表達形式主要為包涵體。洗滌溶解后采用鎳離子親合層析得到純度為90％以上的RGD-IL-24 蛋白。復(fù)性的RGD-IL-24 蛋白冷凍抽干后保存。
　　 3. MTT 檢測細胞的體外增殖實驗證實，RGD-IL-24 和IL-24

7、 治療后的腫瘤細胞A549、HepG-2、HeLa 和ACHN 增殖明顯被抑制，均與對照組增殖狀況有顯著性差異(均P<0.01)，但對正常細胞NHLF 無影響。進一步分析發(fā)現(xiàn)RGD-IL-24 抑制腫瘤增殖的效果比IL-24 顯著增強(P<0.05)。
　　 4. FITC-annexin V 和DAPI 染色檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，RGD-IL-24 和IL-24 治療后的腫瘤細胞A549、HepG-2、HeLa 和ACHN 凋

8、亡明顯，均與對照組有顯著性差異(均P<0.01)，但正常細胞NHLF 無凋亡。進一步分析發(fā)現(xiàn)RGD-IL-24 誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的效果比IL-24 顯著增強(P<0.05)。
　　 5. western blot 檢測Bax 和Bcl2 蛋白表達及caspase-3 的活化情況，RGD-IL-24 和IL-24 治療48 小時后，4 種腫瘤細胞A549、HepG-2、HeLa 和ACHN 中bax/bcl2 的比值是增加的，RG

9、D-IL-24 組增加較高。同樣，RGD-IL-24和IL-24 治療48 小時后，腫瘤細胞中檢測到活化的caspase-3，且RGD-IL-24組caspase3 活化較多。
　　 6. 用RGD-IL-24 蛋白誘導(dǎo)人PBMC 產(chǎn)生IL-6、TNF-α和INF-γ的能力為指標(biāo)，測定RGD-IL-24 突變蛋白的免疫刺激活性，結(jié)果顯示，RGD-IL-24 誘導(dǎo)人PBMC 產(chǎn)生IL-6、TNF-α和INF-γ的能力比IL-24

10、顯著提高(P<0.05)。
　　 7. 細胞粘附實驗和粘附抑制實驗表明，RGD-IL-24 通過RGD 肽靶向性的與腫瘤細胞整合素αvβ3 結(jié)合，能夠特異性地作用于腫瘤細胞。
　　 結(jié)論：
　　 1. 成功構(gòu)建IL-24 突變體RGD-IL-24，并在大腸桿菌高效表達重組蛋白RGD-IL-24，且建立了RGD-IL-24 的純化和復(fù)性工藝。
　　 2. RGD-IL-24 蛋白具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫