人cubilin蛋白突變體的構(gòu)建與功能研究.pdf

1、腎小管上皮細(xì)胞超負(fù)荷重吸收白蛋白可通過(guò)多種途經(jīng)損傷腎組織，最終導(dǎo)致慢性腎功能衰竭[1,2]。Cubilin是分布于腎近曲小管上皮細(xì)胞刷狀緣負(fù)責(zé)重吸收白蛋白等大分子物質(zhì)的吞飲受體[3-5]。在cubilin缺陷的人和狗，均出現(xiàn)大量白蛋白尿，但腎組織無(wú)明顯病理改變[6-8]，也不會(huì)進(jìn)展為慢性腎功能衰竭[9]。我們的研究表明，腎病綜合征患者腎小管上皮細(xì)胞cubilin表達(dá)上調(diào)，重吸收白蛋白增加，與腎小管間質(zhì)MCP-1和RANTES表達(dá)增加和炎

2、癥細(xì)胞浸潤(rùn)的改變相關(guān)[10]，而反義cubilinRNA，在抑制白蛋白超負(fù)荷重吸收的同時(shí)，也明顯抑制腎小管上皮細(xì)胞MCP-1和RANTES的表達(dá)[11]，提示cublilin在介導(dǎo)白蛋白超負(fù)荷引起的腎小管間質(zhì)損害中具有重要作用。 Cubilin全長(zhǎng)3623aa，460kD，由N-端，8個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)和27個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域組成[12]，CUB結(jié)構(gòu)域是主要的功能域，負(fù)責(zé)和絕大部分的配體結(jié)合，其中CUB7-8結(jié)構(gòu)域是白蛋白的結(jié)合域，但二

3、者結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基尚未確定[13]。由于蛋白質(zhì)之間的相互作用是通過(guò)分子內(nèi)部的肽段形成特殊空間結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的(如“配體結(jié)合口袋”負(fù)責(zé)受體與配體間的識(shí)別與結(jié)合)，通常只需幾個(gè)關(guān)鍵功能殘基決定其相互作用的效率。針對(duì)Cubilin各段生物學(xué)功能不同的特性，選取能夠與白蛋白結(jié)合的CUB7-8功能片段為研究對(duì)象，以同源模建方法建立CUB8功能域的三維模型，并以計(jì)算機(jī)輔助的分子對(duì)接方法預(yù)測(cè)CUB8功能域與白蛋白的候選結(jié)合氨基酸殘基，通過(guò)原核表達(dá)野生型

4、和突變型CUB7-8蛋白片段，利用生物傳感器技術(shù)，測(cè)定野生型和突變型CUB7-8蛋白片段與白蛋白的親和力，以確定cubilin與白蛋白結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基，為進(jìn)一步研究cubilin的生理功能和病理生理意義奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法 1.利用NCBI和PDB數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索CUB8的氨基酸序列及與該片段相似性較高且已經(jīng)解析三維結(jié)構(gòu)的模板蛋白，再利用insightⅡ工作站對(duì)CUB8蛋白片段進(jìn)行同源模建，然后對(duì)得到的CUB8蛋白片段和

5、白蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，尋找白蛋白和CUB8的候選結(jié)合氨基酸殘基。 2.利用基因重組技術(shù)構(gòu)建野生型(命名為PCW)、點(diǎn)突變P1297L(命名為PCS)、缺失突變型Arg100-Arg101-Glu102-Lys103(蛋白全序列的第1377至1380位，命名為PCD-1)和Asp59-Tyr60_Leu61-Glu62_Leu63-Tyr64(蛋白全序列的第1336至1341，命名為PCD-2)CUB7-8-GST融合蛋白原核表達(dá)載

6、體。IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，親和層析法純化融合蛋白，經(jīng)凝血酶酶切純化后，獲得目的蛋白片段。 3.人白蛋白包被生物傳感器芯片，分別測(cè)定野生型及突變型CUB7-8蛋白與白蛋白的親和力。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.模板蛋白TheAcidicseminalfluidprotein(ASFP)與目的蛋白CUB8蛋白片段的同源性為31％，同源模建獲得了CUB8蛋白片段的三維空間結(jié)構(gòu)。利用計(jì)算機(jī)輔助的分子對(duì)接技術(shù)，獲得兩個(gè)候選結(jié)合域，表面電

7、勢(shì)能分析顯示，CUB8蛋白片段氨基酸殘基富集正電荷，白蛋白的候選結(jié)合域富集負(fù)電荷，二者可以通過(guò)正負(fù)電勢(shì)的吸引，完成受體與配體的結(jié)合。 2.野生型表達(dá)載體PCR和雙酶切方法初步鑒定結(jié)果證實(shí)插入片段同CUB7-8片段大小一致，測(cè)序結(jié)果顯示目的片段插入正確。突變型表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果顯示突變位點(diǎn)為設(shè)計(jì)位點(diǎn)。重組載體轉(zhuǎn)化成功后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了分子量約52kD的野生型及突變型融合蛋白，westernblot證實(shí)為GST融合蛋白。凝膠

8、掃描系統(tǒng)軟件進(jìn)行圖象灰度分析，顯示可溶性GST-融合蛋白的表達(dá)量約占菌體蛋白的8％左右。親和層析技術(shù)獲得純化的融合蛋白，凝血酶酶切后，得到了大小約為26kD，純度約為80％的目的蛋白片段。 3.白蛋白包被于傳感器芯片，分別進(jìn)行野生型和突變型蛋白與白蛋白親和力的測(cè)定，PCW，PCS，PCD-1與白蛋白結(jié)合的Kd值分別為1.48×10-7，6.73×10-7，5.137×10-7，而PCD-2不能和白蛋白結(jié)合。 結(jié)論