人cubilin蛋白突變體的構(gòu)建與功能研究.pdf

1、腎小管上皮細胞超負荷重吸收白蛋白可通過多種途經(jīng)損傷腎組織，最終導致慢性腎功能衰竭[1,2]。Cubilin是分布于腎近曲小管上皮細胞刷狀緣負責重吸收白蛋白等大分子物質(zhì)的吞飲受體[3-5]。在cubilin缺陷的人和狗，均出現(xiàn)大量白蛋白尿，但腎組織無明顯病理改變[6-8]，也不會進展為慢性腎功能衰竭[9]。我們的研究表明，腎病綜合征患者腎小管上皮細胞cubilin表達上調(diào)，重吸收白蛋白增加，與腎小管間質(zhì)MCP-1和RANTES表達增加和炎

2、癥細胞浸潤的改變相關(guān)[10]，而反義cubilinRNA，在抑制白蛋白超負荷重吸收的同時，也明顯抑制腎小管上皮細胞MCP-1和RANTES的表達[11]，提示cublilin在介導白蛋白超負荷引起的腎小管間質(zhì)損害中具有重要作用。 Cubilin全長3623aa，460kD，由N-端，8個EGF樣結(jié)構(gòu)和27個CUB結(jié)構(gòu)域組成[12]，CUB結(jié)構(gòu)域是主要的功能域，負責和絕大部分的配體結(jié)合，其中CUB7-8結(jié)構(gòu)域是白蛋白的結(jié)合域，但二

3、者結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基尚未確定[13]。由于蛋白質(zhì)之間的相互作用是通過分子內(nèi)部的肽段形成特殊空間結(jié)構(gòu)實現(xiàn)的(如“配體結(jié)合口袋”負責受體與配體間的識別與結(jié)合)，通常只需幾個關(guān)鍵功能殘基決定其相互作用的效率。針對Cubilin各段生物學功能不同的特性，選取能夠與白蛋白結(jié)合的CUB7-8功能片段為研究對象，以同源模建方法建立CUB8功能域的三維模型，并以計算機輔助的分子對接方法預測CUB8功能域與白蛋白的候選結(jié)合氨基酸殘基，通過原核表達野生型

4、和突變型CUB7-8蛋白片段，利用生物傳感器技術(shù)，測定野生型和突變型CUB7-8蛋白片段與白蛋白的親和力，以確定cubilin與白蛋白結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基，為進一步研究cubilin的生理功能和病理生理意義奠定基礎。 實驗方法 1.利用NCBI和PDB數(shù)據(jù)庫，搜索CUB8的氨基酸序列及與該片段相似性較高且已經(jīng)解析三維結(jié)構(gòu)的模板蛋白，再利用insightⅡ工作站對CUB8蛋白片段進行同源模建，然后對得到的CUB8蛋白片段和

5、白蛋白進行分子對接，尋找白蛋白和CUB8的候選結(jié)合氨基酸殘基。 2.利用基因重組技術(shù)構(gòu)建野生型(命名為PCW)、點突變P1297L(命名為PCS)、缺失突變型Arg100-Arg101-Glu102-Lys103(蛋白全序列的第1377至1380位，命名為PCD-1)和Asp59-Tyr60_Leu61-Glu62_Leu63-Tyr64(蛋白全序列的第1336至1341，命名為PCD-2)CUB7-8-GST融合蛋白原核表達載

6、體。IPTG誘導蛋白表達，親和層析法純化融合蛋白，經(jīng)凝血酶酶切純化后，獲得目的蛋白片段。 3.人白蛋白包被生物傳感器芯片，分別測定野生型及突變型CUB7-8蛋白與白蛋白的親和力。 實驗結(jié)果 1.模板蛋白TheAcidicseminalfluidprotein(ASFP)與目的蛋白CUB8蛋白片段的同源性為31％，同源模建獲得了CUB8蛋白片段的三維空間結(jié)構(gòu)。利用計算機輔助的分子對接技術(shù)，獲得兩個候選結(jié)合域，表面電

7、勢能分析顯示，CUB8蛋白片段氨基酸殘基富集正電荷，白蛋白的候選結(jié)合域富集負電荷，二者可以通過正負電勢的吸引，完成受體與配體的結(jié)合。 2.野生型表達載體PCR和雙酶切方法初步鑒定結(jié)果證實插入片段同CUB7-8片段大小一致，測序結(jié)果顯示目的片段插入正確。突變型表達載體測序結(jié)果顯示突變位點為設計位點。重組載體轉(zhuǎn)化成功后，IPTG誘導表達，獲得了分子量約52kD的野生型及突變型融合蛋白，westernblot證實為GST融合蛋白。凝膠

8、掃描系統(tǒng)軟件進行圖象灰度分析，顯示可溶性GST-融合蛋白的表達量約占菌體蛋白的8％左右。親和層析技術(shù)獲得純化的融合蛋白，凝血酶酶切后，得到了大小約為26kD，純度約為80％的目的蛋白片段。 3.白蛋白包被于傳感器芯片，分別進行野生型和突變型蛋白與白蛋白親和力的測定，PCW，PCS，PCD-1與白蛋白結(jié)合的Kd值分別為1.48×10-7，6.73×10-7，5.137×10-7，而PCD-2不能和白蛋白結(jié)合。 結(jié)論