人卵透明帶蛋白3突變體的構建及其在畢赤酵母中的表達.pdf

1、本研究利用重疊延伸PCR介導的定點誘變技術對人卵透明帶3(hZP3)序列中三個潛在的酵母蛋白水解酶切割位點進行突變。通過消除這些蛋白酶切位點，希望能得到沒有降解的重組hZP3蛋白。此外，本研究的另一個目的就是探討hZP3序列中的C端跨膜區(qū)以及作為純化標簽的多聚組氨酸在目的蛋白中的位置對于巴氏畢赤酵母所表達的重組hZP3蛋白的表達量和純化過程的影響。天然hZP3的C端跨膜區(qū)在分泌途徑中已經被切除，并沒有出現(xiàn)在成熟肽中，但是由于這段序列的疏

2、水性，可能會對重組蛋白的表達過程產生影響。多聚組氨酸標簽的作用是為了方便目的蛋白的純化，但它在目的蛋白中的位置可能改變蛋白的結構進而影響蛋白的表達和純化。為此，我們設計實驗如下：選用pPIC9K-6×his和pPICZaA作為表達載體。pPIC9K-6×his是由商品化的表達載體pPIC9K改造而成，通過PCR在pPIC9K的SnaBI和EcoRI位點之間插入一段編碼6個組氨酸和2個甘氨酸的DNA片斷，使表達出來的目的蛋白在N端有6個串

3、聯(lián)的組氨酸純化標簽。根據C端跨膜區(qū)的有無和引入酶切位點的不同，通過重疊延伸PCR構建4個hZP3基因突變體。經過酶切和連接，將突變的hZP3基因片斷分別克隆到載體pPIC9K-6×his和pPICZaA中。4個重組質粒經SacI線性化處理后轉化入畢赤酵母GS115中表達重組hZP3蛋白。表達產物經SDS-PAGE和Western-blot鑒定分析，結果表明：(1)通過定點誘變消除潛在蛋白酶切位點成功抑制了表達產物的降解；(2)C—端跨膜