新型綠色熒光蛋白突變體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、綠色熒光蛋白(GFP)作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白,其作用是任何其他酶類報告蛋白無法比擬的。它是單體蛋白,自發(fā)熒光,熒光反應(yīng)無需外加輔助因子,其突變體Emerald不需要紫外激發(fā)光,在可見光下肉眼便可以觀測到,其熒光性質(zhì)穩(wěn)定,對光漂白有耐受性。在受到強(qiáng)還原劑的影響會喪失熒光,但是將其在放置在有氧氣的環(huán)境下,熒光就會恢復(fù)。此外,綠色熒光蛋白毒性低,可以直接用于活體細(xì)胞的檢測。GFP是單體蛋白,分子量小,靶蛋白可以融合入在 GFP的C端或

2、者N端,對GFP的熒光強(qiáng)度的影響都很小。而且,綠色熒光蛋白具有光譜性,其突變體幾乎可以在大多生物中可溶性表達(dá)。
　　本文初步研究獲得一種新型的超折疊綠色熒光突變體及其循環(huán)突變體,在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)和純化,并對其突變體進(jìn)行了光譜學(xué)性質(zhì)分析,通過在新型的超折疊綠色熒光突變體的上游插入增強(qiáng)序列,與EmGFP的熒光強(qiáng)度比較,分析了表達(dá)標(biāo)簽對蛋白的表達(dá)的影響。獲得如下主要結(jié)果:
　　1.定點突變:根據(jù)文獻(xiàn)報道結(jié)果,定點突變祖母綠

3、GFP,獲得六個氨基酸殘基突變的新型綠色熒光蛋白突變體 EsGFP(S30R、Y39N、N105T、Y145F、I171V和A206V)。
　　2.位點突變:設(shè)計引物,在pET28b載體上進(jìn)行TEV蛋白酶的特異性酶切識別位點的插入,利于純化蛋白的組氨酸標(biāo)簽的有效切除。
　　3.蛋白重組純化:構(gòu)建大腸桿菌新型超折疊綠色熒光蛋白 EsGFP、循環(huán)突變體CNGFP的表達(dá)載體pET28btev-EsGFP、pET28btev-CNG

4、FP和帶有表達(dá)標(biāo)簽的超折疊綠色熒光蛋白pET28btev-Ex-EsGFP,Ni-NTA純化獲得純度較單一的EsGFP、CNGFP蛋白,利用TEV蛋白酶去除His-tag標(biāo)簽,獲得不含組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白。
　　4.光譜學(xué)性質(zhì):紫外可見光光譜和熒光光譜分析正裝的超折疊綠色熒光蛋白突變體和倒裝的超折疊綠色熒光蛋白循環(huán)突變體的譜峰沒有發(fā)生明顯的變化,說明倒裝的超折疊綠色熒光蛋白循環(huán)突變體的光譜學(xué)性質(zhì)沒有發(fā)生明顯的變化。帶有組氨酸標(biāo)簽和

5、不帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白峰值沒有發(fā)生明顯變化,但是峰型發(fā)生了明顯變化,說明組氨酸標(biāo)簽對蛋白的晶體生長有一定的影響。
　　5.晶體生長:將純化的去除組氨酸標(biāo)簽的循環(huán)突變體 CNGFP蛋白超濾至濃度為10 mg/mL,母液為20 mmol/L Tris-HCl,pH8.0。采用懸滴法,Hampton Screen I&II98種篩選條件,在10℃恒溫生長一周后,顯微鏡下觀察,第74和84號條件獲得微晶,其中74號條件:0.05 mol/L

6、硫化銫,0.1 mol/LMES,pH6.5,30％聚醚胺M-600中晶體生長最優(yōu),為柱狀晶型。
　　6.熒光強(qiáng)度:在EsGFP基因上游添加表達(dá)標(biāo)簽以增強(qiáng)熒光強(qiáng)度,分析了新型超折疊綠色熒光蛋白突變體EsGFP和加入表達(dá)標(biāo)簽的EsGFP(Ex-EsGFP)在IPTG誘導(dǎo),28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)后,大腸桿菌重組在可見光和紫外光下顯示綠色,熒光值數(shù)據(jù)分析, EsGFP的熒光強(qiáng)度比EmGFP的熒光強(qiáng)度高出8.87%;Ex-EsGFP的熒光強(qiáng)度比E

7、sGFP的熒光強(qiáng)度高出18.93%。
　　綜上所述,本研究獲得了EsGFP、CNGFP、Ex-EsGFP的基因,獲得新型超折疊綠色熒光突變體EsGFP(S30R、Y39N、N105T、Y145F、I171V和A206V)、循環(huán)突變體CNGFP和含有表達(dá)標(biāo)簽的新型超折疊綠色熒光突變體Ex-EsGFP,分析了EsGFP和CNGFP在大腸桿菌中的重組表達(dá),親和純化獲得了蛋白,紫外熒光光譜掃描表明組氨酸標(biāo)簽對晶體生長有一定的影響,對突變體