抗肺癌單鏈抗體融合綠色熒光蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及活性研究.pdf

1、抗肺癌單鏈抗體(LC-1 single-chain Fv,LC-1 ScFv)是由抗肺癌雜交瘤細(xì)胞株(LC-1)分泌的單克隆抗體經(jīng)過基因改造得到的,是具有與抗原結(jié)合能力的最小抗體片段.由于分子量小,所以與傳統(tǒng)的單克隆相比具有組織穿透能力強(qiáng)、免疫原性低的優(yōu)點(diǎn).該文首次將完整的抗肺癌單鏈抗體與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)結(jié)合進(jìn)行融合表達(dá).理論上如果蛋白表達(dá),應(yīng)同時具有抗體活性及光激發(fā)綠色熒光雙重

2、功能.這為腫瘤的檢測、藥物篩選、細(xì)胞因子受體的分布以及功能等方面的研究開辟了廣闊的應(yīng)用前景.該實(shí)驗(yàn)從高分泌量和活力較高的抗肺癌雜交瘤單克隆細(xì)胞株抽提總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA.設(shè)計(jì)引物從cDNA中PCR克隆出單鏈抗體的重鏈和輕鏈基因,克隆到T載體并測序.經(jīng)重疊延伸PCR法將重鏈和輕鏈基因構(gòu)建為單鏈抗體形式.修飾后的單鏈抗體與pET-22b(+)質(zhì)粒連接,構(gòu)建成pET22-scfv,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21.在溫度30℃,誘導(dǎo)5h,IPTG的

3、濃度為0.5 mmol/L時誘導(dǎo)菌體,單鏈抗體的表達(dá)量占全菌蛋白的40%.表達(dá)的蛋白尚未分泌到胞間質(zhì),而是幾乎全部以包涵體形式存在.將包涵體抽提后通過蛋白復(fù)性技術(shù)使之復(fù)性,用Ni-NTA樹脂純化出目標(biāo)蛋白,SDS-PAGE電泳分析其純度達(dá)到90%以上.競爭ELISA實(shí)驗(yàn)表明產(chǎn)物具有與天然抗體相近的活力.ScFv通過基因工程方法的大量制備,克服了單克隆抗體腹水制備的有限性,降低了生產(chǎn)成本低.同時設(shè)計(jì)引物,以帶有突變型綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒