抗Aβ人源單鏈抗體基因的篩選和全抗體基因的構(gòu)建及表達(dá)研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimetr disease，AD)是一種以老年人中進(jìn)行性記憶障礙和智能衰退為主要臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)和神經(jīng)突觸減少或神經(jīng)元丟失是AD的主要病理特征。其中老年斑的主要成分是β-淀粉樣多肽(beta-amyloidpeptide，Aβ)聚集形成的纖維，而Aβ纖維被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及認(rèn)知

2、功能衰退的主要致病物質(zhì)。針對A B多肽在發(fā)病中的關(guān)鍵作用，研究如何阻止Aβ多肽聚集及清除大腦病變區(qū)已形成的Aβ多肽纖維已成為研究AD治療的前沿領(lǐng)域，抗Aβ多肽抗體治療AD也成為AD研究中的一個熱點(diǎn)。動物試驗(yàn)已證明抗Aβ多肽抗體有清除小鼠大腦中Aβ纖維斑塊防治AD的作用，但至今尚未見人源化抗體有臨床應(yīng)用的報道。 本課題研究從人源噬菌體單鏈抗體庫中篩選針對Aβ的單鏈抗體可變區(qū)(scFv)基因，并以基因工程構(gòu)建人源抗Aβ全抗體的真核表

3、達(dá)體系。主要包括兩部分：第一，從構(gòu)建的人源噬菌體單鏈抗體庫中篩選抗Aβ的scFv基因，在原核細(xì)胞中進(jìn)行可溶性表達(dá)，并進(jìn)行抗體結(jié)合活性和生物學(xué)活性檢測；第二，重組IgG全抗體輕重鏈基因及全抗體單鏈基因，構(gòu)建真核表達(dá)體系，進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)的初步研究。 一、抗Aβ人源scFv基因的篩選、原核表達(dá)與鑒定以Aβ1-42多肽為抗原對抗體庫進(jìn)行4輪富集篩選：用輔助噬菌體M13K07感染E.coli TG1轉(zhuǎn)化菌，展示出噬菌體形式的抗體庫。將此

4、抗體庫加入到用Aβ1-42多肽包被的96孔板內(nèi)，孵育一段時間后洗滌，能夠與抗原特異結(jié)合的scFv噬菌體克隆將被保留在96孔板內(nèi)壁，然后用pH 2.2的甘氨酸-HC1緩沖液將特異結(jié)合的噬菌體洗脫下來，經(jīng)pH8.0的Tris-HC1中和后，感染處于對數(shù)生長期的E.coli TG1，以擴(kuò)增抗原特異性噬菌體克隆。這樣，經(jīng)過4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的富集過程，抗體庫中與Aβ1-42多肽特異性結(jié)合的噬菌體克隆從第1輪的3.31×104增加到第4輪的

5、7.65×10-2，得到了高度富集，多克隆噬菌體Elisa檢測也顯示了明確的富集效果。隨機(jī)挑取80個克隆，用M13K07感染后使scFv展示于噬菌體顆粒表面，ELISA篩選展示有抗Aβ1-42多肽scFv的噬菌體克隆。檢測結(jié)果顯示，得到7個陽性克隆，其中4個克隆ELISA檢測A值高于陰性對照5倍以上，另外3個在2.5～3倍之間。所有陽性克隆均與無關(guān)抗原BSA無交叉反應(yīng)。對其中A值最高的2個克隆(A10、F2)的噬菌體顆粒上清感染E.Co

6、li HB2151，30℃，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)20h，分別制備胞周質(zhì)、培養(yǎng)基上清和全細(xì)胞提取物。經(jīng)12％SDS-PAGE和western blot分析，目的蛋白相對分子量為33kD，主要集中于全細(xì)胞提取物，表達(dá)量占全菌蛋白60％左右。表達(dá)抗體ELISA檢測上清中和全菌蛋白中A值分別高于陰性對照5倍以上，在胞周質(zhì)中高于2倍以上?？贵w與Aβ1-40也有結(jié)合反應(yīng)，但與BSA無交叉反應(yīng)，顯示scFv抗體對Aβ具有特異性，結(jié)合位點(diǎn)主要在Aβ的N端。

7、表達(dá)抗體的生物學(xué)活性鑒定示，可與人腦病變組織內(nèi)淀粉樣斑塊中的抗原物質(zhì)Aβ纖維結(jié)合，證明表達(dá)的scFv抗體可以應(yīng)用于體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。將A10、F2克隆菌測序，用blast分析得到的scFv基因序列，從中分別確定了VH與VL的DNA序列，推導(dǎo)得到的氨基酸序列具有典型的抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)。2個克隆的基因序列一致，表明2個克隆菌可能來源于同一株原始噬粒。 二、抗Aβ人源全抗體基因的重組構(gòu)建、真核表達(dá)研究首先對前期獲得的A10克隆scFv

8、基因進(jìn)行NCBI blast比對，獲得VH和VL基因相應(yīng)的成熟信號肽基因，并合成信號肽基因，再設(shè)計特異引物分別擴(kuò)增A10克隆的VH、VL、scFv基因和人源IgG的CH、CL、FC段基因，并利用重組PCR(overlap PCR)方法重組IgG全抗體重鏈基因(H信號肽基因+VH基因+CH基因)、IgG全抗體輕鏈基因(L信號肽基因+VL基因+CL基因)和全抗體單鏈基因(H信號肽基因+scFv基因+FC段基因)，然后分別克隆到pcDNA3.

9、1真核表達(dá)載體內(nèi)。菌液PCR、雙酶切鑒定和DNA測序結(jié)果均顯示，重組的三種基因片段大小與預(yù)期一致，基因序列與預(yù)期的序列完全一致，讀碼框架和插入真核表達(dá)載體的方向完全正確。將IgG全抗體重鏈基因-載體質(zhì)粒和IgG全抗體輕鏈基因-載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，表達(dá)IgG全抗體；將全抗體單鏈基因-載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，表達(dá)單鏈全抗體(scFv抗體+FC段)。兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞初步的表達(dá)產(chǎn)物ELISA結(jié)果未見表達(dá)上清與Aβ1-42有陽性反應(yīng)，后續(xù)工作仍

10、需優(yōu)化細(xì)胞表達(dá)條件?，F(xiàn)有的工作進(jìn)展為今后進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)、動物試驗(yàn)及應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。 目前，雖然國內(nèi)外已有幾家篩選到人源抗Aβ抗體的報道，但都仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，也未見全抗體或進(jìn)入臨床試驗(yàn)的報道。我們所得到的抗Aβ序列經(jīng)過比對，與現(xiàn)有已發(fā)表的抗Aβ抗體序列均不同，表明是一個新的抗Aβ抗體。現(xiàn)已在國內(nèi)申報了專利，同時已完成了全抗體真核表達(dá)體系構(gòu)建工作，后續(xù)的優(yōu)化表達(dá)工作正在進(jìn)行。本課題研究工作的結(jié)果有利于今后進(jìn)一步開展對AD的免