人源抗-抗GBM抗體單鏈抗體scFv3原核載體的構(gòu)建、表達(dá)和純化.pdf

1、背景和目的
　　 抗腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)疾病是一種罕見(jiàn)的自身免疫性疾病，特點(diǎn)是急進(jìn)性腎小球腎炎和肺出血。雖然本病的發(fā)病率低，但多數(shù)患者病情重，預(yù)后差，死亡率高。介導(dǎo)本病的關(guān)鍵因素是抗GBM抗體。抗體與靶抗原結(jié)合后誘發(fā)免疫損傷，導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)的活化，白細(xì)胞的侵潤(rùn)和蛋白尿的產(chǎn)生。因此，抗GBM抗體對(duì)于本病的發(fā)生發(fā)展有重要意義。
　　 隨著對(duì)腎小球基底膜病發(fā)病機(jī)制的深入

2、研究，發(fā)現(xiàn)抗GBM抗體的主要靶抗原位于腎小球基底膜Ⅳ型膠原α3鏈的非膠原區(qū)1中[α3(Ⅳ)NCl]。在正常情況下，抗原表位(EA和EB)處于隱蔽位置。當(dāng)感染、吸煙和接觸有機(jī)溶劑時(shí)，抗原表位暴露，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗GBM抗體。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察已證明，抗腎小球基底膜抗體具有致病性。1967年，Lerner等人在Goodpasture綜合征患者血清和腎臟中發(fā)現(xiàn)了抗GBM抗體，證明將此種抗體注入猴子體內(nèi)可導(dǎo)致腎炎，從而證實(shí)了抗GBM抗體

3、的存在及其致病作用，明確了Goodpasture綜合征的發(fā)病與抗GBM抗體有關(guān)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)抗GBM抗體的亞型、親和力和滴度與病情的嚴(yán)重程度和預(yù)后有明顯相關(guān)。正常人體內(nèi)也能檢測(cè)出抗GBM抗體，但其滴度和親和力都顯著低于患者且亞型不同，提示抗體的特性變化與發(fā)病有重要的關(guān)系。目前抗GBM病的主要治療方法是強(qiáng)化血漿置換和免疫抑制聯(lián)合。血漿置換的目的是清除循環(huán)中的抗GBM抗體，而免疫抑制劑使新的抗體形成減少。國(guó)外報(bào)道，早期應(yīng)用強(qiáng)化血漿置換合并糖

4、皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺治療，85％的患者能夠存活，40％進(jìn)入終末期腎臟病ESRD(end-stage renaldisease)。而早期未診斷治療的患者死亡率可達(dá)89％。因此，積極清除和抑制抗體的產(chǎn)生是治療和改善預(yù)后的關(guān)鍵。如果能獲得針對(duì)抗GBM抗體的特異性抗體，使這種特異性抗體與抗GBM抗體結(jié)合，抑制和阻斷抗GBM抗體與基底膜靶抗原的結(jié)合，那么就可以延緩和阻止疾病的發(fā)生。
　　 目前，噬菌體展示技術(shù)已成為抗體工程的一項(xiàng)重要技術(shù)，它

5、將大量的多肽和蛋白展示在噬菌體表面，建成噬菌體抗體庫(kù)，通過(guò)親和篩選直接從抗體庫(kù)中篩選出特異性強(qiáng)、親和力高的噬菌體抗體。由于噬菌體抗體容易經(jīng)過(guò)改建在大腸桿菌或酵母菌中大規(guī)模生產(chǎn)。因此，噬菌體抗體表現(xiàn)出了巨大的潛能和廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本實(shí)驗(yàn)所用的單鏈抗體scFv3基因是在北京大學(xué)通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選所得。我們通過(guò)基因工程重組技術(shù)和親和層析技術(shù)，得到了純化的單鏈抗體scFv3，經(jīng)間接ELISA試驗(yàn)鑒定了這種單鏈抗體與抗GBM抗

6、體的免疫反應(yīng)性。為獲得大量高純度的單鏈抗體scFv3，以便進(jìn)一步分析其特性和大規(guī)模生產(chǎn)，我們將抗體scFv3基因亞克隆入表達(dá)載體PET系統(tǒng)，在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)純化。
　　 材料與方法：
　　 本實(shí)驗(yàn)以噬菌體展示技術(shù)所篩選的單鏈抗體scFv3基因?yàn)槟０澹琗P1和XP2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將目的基因回收后克隆入pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10，通過(guò)藍(lán)白篩選，選出陽(yáng)性克隆。經(jīng)PCR和酶切鑒定證實(shí)克隆

7、載體pGEM-scFv3構(gòu)成。提取質(zhì)粒DNA，用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ.雙酶切，再將目的DNA片段亞克隆入原核表達(dá)載體pET28a(+)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。選出陽(yáng)性克隆，進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。鑒定之后，將重組菌用IPTG30℃誘導(dǎo)表達(dá)20小時(shí)，SDS-PAGE電泳分析。通過(guò)HisLink Spin蛋白純化系統(tǒng)，獲得純化的單鏈抗體scFv3。最后，純化的抗體蛋白經(jīng)間接ELISA法初步檢測(cè)其免疫反應(yīng)性。
　　

8、結(jié)果：
　　 1、擴(kuò)增的基因片段約750bp，與篩選所得的scFv3基因大小相符。
　　 2、PCR和酶切鑒定證實(shí)scFv3基因已插入pGEM-T Easy載體，克隆載體pGEM-scFv3構(gòu)建成功。
　　 3、PCR和酶切證實(shí)scFv3基因已亞克隆入表達(dá)載體pET28a(+)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。測(cè)序驗(yàn)證克隆入表達(dá)載體的基因序列與篩選所得的單鏈抗體scFv3基因序列相同。
　　 4、SDS-

9、PAGE電泳顯示重組菌誘導(dǎo)表達(dá)出一條明顯的蛋白條帶，分子量在27kD左右。
　　 5、通過(guò)親和層析技術(shù)，獲得了純化的scFv3蛋白。
　　 6、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)初步證實(shí)純化的單鏈抗體scFv3與抗GBM抗體有免疫反應(yīng)性。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建了克隆載體pGEM-scFv3。
　　 2、成功構(gòu)建了表達(dá)載體pET28a-scFv3。
　　 3、單鏈抗體scFv3分