人源化抗CTLA-4單鏈抗體及其免疫毒素融合蛋白的表達(dá)與純化研究：原核大腸桿菌與真核畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng).pdf

1、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4，CDl52)是T細(xì)胞共刺激受體CD28的結(jié)構(gòu)同源物，通過與抗原提呈細(xì)胞上CD28的共同配體CD80/CD86相互作用，而在T細(xì)胞反應(yīng)中起負(fù)調(diào)節(jié)作用。CTLA4在活化的T細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)，是T細(xì)胞活化的良好標(biāo)志，可以作為免疫抑制劑和腫瘤治療的靶標(biāo)。 抗CTLA-4單鏈抗體(anti-CTLA4 scFv)具有特異性結(jié)

2、合CDl52的活性，在體外和體內(nèi)是潛在的活化T細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的靶向分子。在抗CTLA-4單鏈抗體上融合具有特殊功能的效應(yīng)分子，能起到對靶細(xì)胞特異殺傷的作用，從而為實現(xiàn)特異性免疫抑制和腫瘤靶向治療提供可能途徑。 人源化抗CTLA-4單鏈抗體及其相關(guān)免疫毒素融合蛋白在生物醫(yī)學(xué)實驗研究和免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病、移植免疫以及腫瘤靶向治療、診斷等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。 本研究以人源化抗CTLA-4單鏈抗體(anti-cTLA4 scF

3、v，簡稱hS)及其相關(guān)免疫毒素融合蛋白(hSP，在hS的C端融合了人穿孔素孔道形成結(jié)構(gòu)域的34個氨基酸的融合蛋白)為研究對象。 為了獲得一定量純化的蛋白以深入研究它們的靶向殺傷功能，而先后在原核大腸桿菌和真核畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)hS和hSP，進(jìn)行純化，初步檢測hS蛋白體外結(jié)合活性，同時比較它們在兩個系統(tǒng)中的表達(dá)情況，為后續(xù)類似蛋白的表達(dá)提供模式和借鑒。結(jié)果如下： 針對原核大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)純化hS和hSP的研究，構(gòu)建了hS和h

4、SP蛋白在原核大腸桿菌系統(tǒng)的表達(dá)質(zhì)粒pQE-hS、pQE-hSP；并在大腸桿菌M15q中以包涵體形式高表達(dá)，表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的30--54％：建立了hS和hSP包涵體洗滌、純化方法和包涵體復(fù)性方法，確定了hS蛋白復(fù)性的條件：在4℃，對復(fù)性液(50mM Tris-C1 pH 8.0，150mM NaCl，3mM GSH，lmM GSSG，1MUrea)透析復(fù)性48小時。hSP蛋白復(fù)性條件：在10℃，對復(fù)性液(50mM Tris-C1 p

5、H 8.0，20 mM NaCI、0.8 mM KCl、1 mM EDTA、1Murea、0.8 ML-arginine和2mM GSH:0.2 mM GSSG)透析18d小時<'[35]>。純化復(fù)性后蛋白的產(chǎn)量：hS，1L培養(yǎng)基產(chǎn)菌體3.866g，洗滌后包涵體1.483g，復(fù)性后蛋白28mg;hSP,1L培養(yǎng)基產(chǎn)菌體3.446g,洗滌后包涵體1.216g，復(fù)性后蛋白20mg。 本研究構(gòu)建了hS和hSP在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)質(zhì)

6、粒pPIC9K-hS和pPIC9K-hSP；電穿孔轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，用Geneticin濃度梯度平板篩選多拷貝插入重組子；經(jīng)過小規(guī)模首次甲醇誘導(dǎo)和兩輪表達(dá)條件優(yōu)化(甲醇濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)起始OD600值)，并通過親和純化濃縮目的蛋白。 從1-1.2 L誘導(dǎo)培養(yǎng)基，可獲得的S濃度從0.32mg／ml提高到1.516mg／ml,產(chǎn)量從1.908mg提高到9.505mg；hSP濃度從0.13mg／ml提高到0.505mg／ml

7、，產(chǎn)量從0.95mg提高到2.525mg。但是，可獲得的SP的濃度始終只有S的20％-30％；SP的產(chǎn)量始終只有S的20％-50％。 誘導(dǎo)后，hS的酵母胞內(nèi)檢測到a-factor-S和S兩種蛋白，hSP胞內(nèi)只檢測到a-factor-SP，且量不及胞內(nèi)S蛋白的三分之一。S蛋白的表達(dá)水平高于SP蛋白。后續(xù)將考慮繼續(xù)優(yōu)化hSP表達(dá)條件，如培養(yǎng)基pH值、降低誘導(dǎo)溫度、考察基因拷貝數(shù)因素等，期望提高SP產(chǎn)量和濃度。 同時，成功

8、構(gòu)建hSP胞內(nèi)可溶表達(dá)載體pPIC3.5K-hSP，進(jìn)行hSP胞內(nèi)表達(dá)探索，期望在不存在分泌壓力的情況下，SP蛋白表達(dá)量能提高。用間接cell-ELISA方法檢測hS體外結(jié)合活性：復(fù)性hS和可溶hS蛋白都能特異的結(jié)合CTLA4陽性Raji細(xì)胞，而對CTLA4陰性ECV-304細(xì)胞結(jié)合值很低。說明復(fù)性hS和可溶hS蛋白具有特異性結(jié)合人CTLA-4抗原的能力。 綜合比較原核E．coli和真核Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)，對