Exendin-4-Tβ4融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及其純化.pdf

1、糖尿病并發(fā)皮膚潰瘍是一種嚴(yán)重的不易治愈的糖尿病并發(fā)癥，研究表明同時使用調(diào)節(jié)血糖的胰島素和促進(jìn)創(chuàng)傷愈合藥物有利于治愈該并發(fā)癥。新型抗糖尿病藥物Exendin-4(以下簡寫為Exn-4)和促進(jìn)創(chuàng)傷愈合因子胸腺素β4(以下簡寫為Tβ4)是分別由39個氨基酸和43個氨基酸組成的小肽，本研究以二者為融合蛋白單體，并在其間引入凝血酶Xa因子切割位點(diǎn)(Ile-Glu-Gly-Arg)，以期在傷口凝血酶作用下，Exn-4-Tβ4融合蛋白能自動裂解成分別

2、產(chǎn)生降血糖和皮膚創(chuàng)傷修復(fù)功能的Exn-4和Tβ4單體來發(fā)揮作用，從而達(dá)到同時治療糖尿病及其皮膚潰瘍并發(fā)癥的效果。通過重疊PCR技術(shù)獲得融合蛋白基因Exn-4-Tβ4，并將此融合基因進(jìn)行克隆和原核表達(dá)，最后制備出純化融合蛋白，為下一步的糖尿病和其并發(fā)癥皮膚潰瘍治療效果實(shí)驗奠定基礎(chǔ)。 利用經(jīng)過重疊PCR擴(kuò)增得到的融合基因Exn-4-Tβ4，構(gòu)建了分泌型表達(dá)載體pET22b-Exn-4-Tβ4和融合表達(dá)載體pET32a-Exn-4-T

3、β4，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，經(jīng)金屬親和層析、透析除鹽、腸激酶酶切后，進(jìn)行冷凍干燥，制備出純化融合蛋白。 對構(gòu)建的重組載體pET22b-Exn-4-Tβ4和pET32a-Exn-4-Tβ4分別進(jìn)行分泌型和融合型表達(dá)，結(jié)果表明用pET32a-Exn-4-Tβ4重組載體得到較理想的可溶性蛋白，SDS-PAGE分析顯示目的蛋白大小與預(yù)期理論值一致。因此，pET32a-Exn-4-Tβ4重組載體