沙眼衣原體熱休克蛋白60原核表達載體的構(gòu)建、表達和蛋白純化.pdf

1、背景與目的： 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，C．t)是性傳播疾病的常見病原體之一。衣原體生殖道感染發(fā)病率逐年增加，女性若發(fā)生C．t的反復(fù)、慢性感染，可導(dǎo)致輸卵管粘連、狹窄甚者閉鎖，繼而引發(fā)異位妊娠(EP)和輸卵管不育(TFI)等，其具體機制尚不清楚。多數(shù)研究者認為免疫反應(yīng)在慢性損傷后遺癥的發(fā)生中起很大作用，其中沙眼衣原體熱休克蛋白60(cHsp60)在免疫致病中起關(guān)鍵作用。 cHsp60是衣原體

2、EB外膜的主要成分，基本功能是參與細胞結(jié)構(gòu)的維持、修復(fù)和免疫，與人的相應(yīng)Hsp60有48％的同源性。到目前為止，已有多項報告說明cHsp60與人類衣原體性疾病的免疫致病機制相關(guān)，推測cHsp60可能是人類衣原體疾病免疫致病的重要因素，是刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的重要表面抗原。對cHsp60保守抗原決定簇的自身免疫應(yīng)答可能是引起人體局部免疫反應(yīng)，導(dǎo)致女性輸卵管損傷的關(guān)鍵因素。 國外研究表明，持續(xù)、長期的cHsp60抗體反應(yīng)與輸卵管中C

3、．t的存在有關(guān)，而且Ct感染持續(xù)存在時間越長，cHsp60抗體反應(yīng)越強，疾病越嚴重。目前對cHsp60的研究主要集中在抗原成分的識別及免疫致病機制方面，尚未有合適的能反映cHsp60抗體反應(yīng)的免疫病理過程的動物模型，致病機制尚不清楚。目前國內(nèi)的相關(guān)研究僅限于cHsp60抗原的表達及血清學(xué)檢測的水平，動物模型和組織免疫病理學(xué)研究仍處于待開發(fā)狀態(tài)。 本研究的目的：構(gòu)建cHsp60原核表達載體pET28a-cHsp60并誘導(dǎo)其表達，純

4、化出可溶形式的目的蛋白。為下一步動物實驗研究慢性上生殖道炎癥模式下主要與cHsp60抗原有關(guān)的血清學(xué)的改變、免疫病理學(xué)變化及證實cItsp60是否為疾病發(fā)生過程中的關(guān)鍵因素提供cHsp60抗原。 材料與方法： 1.構(gòu)建重組表達載體依據(jù)cHsp60基因序列，設(shè)計一對特異性引物，PCR法擴增目的基因。雙酶切擴增片段和表達載體，酶切產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入克隆菌株，篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，PCR、雙酶切和測序鑒定。 2

5、.目的蛋白的表達與純化將單個轉(zhuǎn)化菌擴大培養(yǎng)，以最佳條件誘導(dǎo)表達，收集菌體，超聲波裂解，收集上清液，鎳凝膠親和層析得到純化的目的蛋白。SDS-PAGE和Western-blot法檢測純化效果。標(biāo)定最終體積、濃度，保存目的蛋白備用。 結(jié)果： 1.重組表達載體的鑒定應(yīng)用PCR的方法，成功擴增出大量的目的基因片段，電泳檢測結(jié)果與理論預(yù)測值相符。重組質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定結(jié)果也與理論值一致，表明目的基因已成功插入表達載體中。重組體

6、DNA測序顯示與Genebank一致。 2.目標(biāo)蛋白的鑒定純化蛋白產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western-blot檢測可觀察到清晰的特異條帶，表明目的蛋白已有效分離，并具有抗原性。 結(jié)論： 1.pEI系統(tǒng)是一個功能強大的表達系統(tǒng)，應(yīng)用pET-28a質(zhì)?？寺Hsp60基因、表達融合蛋白是可行的，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生可溶的活性蛋白。 2.利用His-tag融合標(biāo)簽可以高效、快速地純化目的蛋白。 3.木實驗證