沙眼衣原體CT703蛋白在感染細胞中的表達及功能初探.pdf

1、一、研究目的：
　　 1.研究CT703蛋白在沙眼衣原體感染細胞中的表達模式、持續(xù)性感染狀態(tài)下CT703蛋白的表達變化。
　　 2.研究CT703蛋白對Raf/MEK/ERK信號通路的激活及抗凋亡作用。
　　 二、研究方法：
　　 1.RT-PCR法擴增沙眼衣原體L2血清型CT703基因全長序列并亞克隆到原核表達質粒pGEX-6p-1中。
　　 2.IPTG誘導重組質粒pGEX-6p-1/CT70

2、3在大腸桿菌BL21中表達相應的重組融合蛋白，利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并純化重組融合蛋白，以純化的重組融合蛋白作為免疫原免疫小鼠制備抗CT703蛋白多克隆抗體。
　　 3.采用Western Blot和免疫熒光技術，以抗CT703蛋白多克隆抗體為一抗檢測CT703蛋白在沙眼衣原體急性感染狀態(tài)下的表達模式。
　　 4.采用RT-PCR和Western Blot技術分別檢測在干擾素-γ誘導沙眼衣原體持續(xù)性感染狀態(tài)下

3、CT703mRNA和蛋白水平表達變化。
　　 5.構建CT703基因真核表達重組質粒pcDNA4/CT703并轉染HeLa細胞，Western Blot技術檢測CT703蛋白是否活化Raf/MEK/ERK信號通路；并檢測轉染細胞在十字孢堿(Staurosporine，STS)作用下，細胞凋亡率以及Caspase-3活性變化。
　　 三、研究結果：
　　 1.利用RT-PCR技術擴增沙眼衣原體L2血清型CT703基

4、因，擴增片段長度約1.5kb，與預期理論值大小一致。重組質粒pGEX-6p-1/CT703經EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后，約在1.5kb處同樣出現(xiàn)特異性DNA條帶。通過DNA測序，證實插入的基因序列與GenBank公布的CT703基因序列完全一致，表明重組質粒構建成功。
　　 2.原核表達重組質粒pGEX-6p-1/CT703經IPTG在大腸桿菌BL21中誘導表達，純化產物經考馬斯亮藍染色顯示產物分子量約81kDa，由55KDa

5、的CT703蛋白和26KDa的GST蛋白組成，與預期理論的分子量大小一致。以抗GST蛋白抗體為一抗，Western Blot技術檢測純化的重組融合蛋白，在81KDa處檢測到相應的蛋白條帶。WersternBlot實驗證實以重組融合蛋白免疫小鼠制備的抗血清能與CT703蛋白特異性結合；間接ELISA法檢測抗血清效價，結果顯示抗體滴度最高達到1:32000。
　　 3.利用Western Blot技術檢測CT703蛋白在沙眼衣原體急

6、性感染狀態(tài)下的表達，感染后24小時可檢測到相應的蛋白，隨著感染時間的延長，蛋白表達量逐漸增多，并持續(xù)存在于整個感染過程，未感染細胞組沒有檢測到CT703蛋白的表達；通過免疫熒光技術檢測CT703蛋白表達，最早在感染12小時即可檢測到相應的蛋白。在干擾素-γ誘導沙眼衣原體持續(xù)性感染狀態(tài)下，RT-PCR和Western Blot技術檢測CT703 mRNA和蛋白的表達情況，結果表明持續(xù)性感染狀態(tài)下CT703 mRNA和蛋白表達不呈時間依賴性

7、，相同時間點沙眼衣原體持續(xù)性感染狀態(tài)下CT703 mRNA和蛋白水平明顯低于急性感染狀態(tài)。
　　 4.間接免疫熒光技術對內源性的CT703蛋白進行定位，結果顯示沙眼衣原體感染細胞CT703蛋白的熒光染色部位既不同于胞漿蛋白CPAF，也不同于包涵體膜蛋白CT813。
　　 5.構建的真核表達重組質粒pcDNA4/CT703經PCR、雙酶切實驗證實插入片段大小與CT703基因片段大小一致，測序證實插入的基因序列與GenBan

8、k公布的CT703基因序列完全一致。重組質粒pcDNA4/CT703轉染到HeLa細胞后，Western Blot和免疫熒光實驗均能檢測到CT703蛋白的表達。
　　 6.真核表達重組質粒pcDNA4/CT703轉染HeLa細胞后36小時檢測磷酸化的Raf、ERK，發(fā)現(xiàn)二者均未被磷酸化；轉染質粒36小時后，STS誘導細胞凋亡5小時，用流式細胞術檢測細胞凋亡率以及用Caspase-3活性檢測試劑盒檢測Caspase-3活性。同時設

9、STS誘導的HeLa細胞組、STS誘導的沙眼衣原體感染組和正常HeLa細胞組作為對照，發(fā)現(xiàn)4組細胞的凋亡率分別為：(93.1±2.01)％、(91.3±1.67)％、(3.21±0.87)％、(2.08±0.76)％。統(tǒng)計學分析，STS誘導的重組質粒轉染組與正常HeLa細胞組比較有顯著性差異，與STS誘導的衣原體感染組比較有顯著性差異(P<0.05)，與STS誘導的HeLa細胞組比較沒有顯著性差異(P>0.05)。Caspase-3活性

10、檢測結果與細胞凋亡率一致。
　　 四、結論：
　　 1.成功構建原核表達重組質粒pGEX-6p-1/CT703以及真核表達重組質粒pcDNA4/CT703。
　　 2.沙眼衣原體急性感染狀態(tài)下CT703蛋白表達呈時間依賴性增加，持續(xù)性感染狀態(tài)下CT703蛋白表達不呈時間依賴性；相同時間點沙眼衣原體持續(xù)性感染狀態(tài)下CT703蛋白表達明顯低于急性感染狀態(tài)。
　　 3.CT703蛋白不能激活Raf/MEK/ER