IL-1α在沙眼衣原體感染Hela229細胞中的表達及穩(wěn)定表達IL-1α shRNA細胞系的構(gòu)建.pdf

1、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)是一種常見的、嚴格細胞內(nèi)寄生的病原體。Ct侵犯機體可引起泌尿生殖道感染，更為嚴重的是Ct感染與不孕、異位妊娠、宮頸鱗狀上皮細胞癌等疾病發(fā)生相關(guān)。Ct可誘導(dǎo)上皮細胞產(chǎn)生IL-1α、IL-6和TNF-α等多種炎癥因子，參與免疫應(yīng)答，其中IL-1α進一步誘導(dǎo)細胞因子（包括其自身、IL-6和IL-8等），參與Ct感染導(dǎo)致的組織損傷。因此，研究IL-1α在早期炎癥中的作用，為Ct感染的

2、發(fā)病機制、疾病預(yù)防和治療提供實驗依據(jù)。
　　 目的:
　　 1、通過探討IL-1α在Ct感染HeLa229細胞前后，細胞內(nèi)、外IL-1α的表達情況，明確IL-1α在Ct感染細胞的炎癥早期的表達模式;
　　 2、構(gòu)建穩(wěn)定表達IL-1α shRNA的細胞系，為后續(xù)研究Ct誘導(dǎo)炎癥機制提供實驗材料。
　　 方法:
　　 1、Ct感染Hela229細胞，吉姆薩染色后，光學(xué)顯微鏡觀察確定Ct包涵體，以建立C

3、t感染Hela229細胞的模型;
　　 2、用ELISA檢測IL-1α在Ct感染Hela229細胞內(nèi)以及培養(yǎng)上清中的表達;
　　 3、利用基因克隆方法構(gòu)建IL-1α shRNA表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Hela229細胞，經(jīng)G418篩選，構(gòu)建穩(wěn)定表達IL-1αshRNA的細胞系;
　　 4、通過ELISA法檢測各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞IL-1α的表達，篩選出有效抑制內(nèi)源性IL-1α表達的穩(wěn)定細胞系。
　　 結(jié)果:

4、r>　　 1、光學(xué)顯微鏡示細胞內(nèi)的透明折光體為Ct的包涵體，表明Ct感染Hela229細胞模型已建立;
　　 2、Ct感染Hela229細胞36h，與未感染組相比，胞內(nèi)IL-1α明顯上升，有顯著差異（P＜0.05）;
　　 3、成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pRNAT6.1/Neo-siRNA1、2、3、4（4種IL-1αshRNA質(zhì)粒），經(jīng)DNA測序4種重組質(zhì)粒序列正確;
　　 4、透過熒光顯微鏡可見:90％以上穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細

5、胞有綠色熒光GFP表達;
　　 5、Ct成功感染IL-1α shRNA穩(wěn)定細胞系，鏡下觀察細胞內(nèi)未著色空洞即Ct包涵體，表明成功建立Ct感染各穩(wěn)定細胞系的模型;
　　 6、各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系（Ct感染組和TNF-α刺激組）中，psi4-IL-1α-Hela229細胞（IL-1α shRNA穩(wěn)定細胞系）胞內(nèi)IL-1α表達量顯著低于對照組psi-Neg-Hela229細胞(P＜0.05)。
　　 結(jié)論: