沙眼衣原體感染后HeLa-229細(xì)胞的miRNA差異表達(dá)及其功能研究.pdf

1、[目的]miRNA是近些年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)能夠調(diào)控其靶基因表達(dá)水平的小分子RNA家族。目前，miRNA的功能研究主要集中于生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等方面，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miRNA參與了病毒和細(xì)菌這些病原微生物與宿主細(xì)胞的相互作用過(guò)程。本研究的初衷在于進(jìn)一步探索miRNA在微生物感染宿主細(xì)胞過(guò)程中所發(fā)揮的作用及其調(diào)控機(jī)制，拓展我們關(guān)于miRNA功能的認(rèn)識(shí)。
　　[方法]首先在本實(shí)驗(yàn)室建立沙眼衣原體的體外培養(yǎng)模型

2、，使用HeLa-229作為宿主細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增沙眼衣原體。并通過(guò)方法的改進(jìn)提高了衣原體感染宿主細(xì)胞的效率，使絕大多數(shù)細(xì)胞都被沙眼衣原體感染，為之后的miRNA表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)提供更好的基礎(chǔ)，而后使用miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)沙眼衣原體感染宿主細(xì)胞后，細(xì)胞中各個(gè)miRNA的表達(dá)水平的變化。從中篩選表達(dá)水平變化最為顯著的一些，并結(jié)合已有的關(guān)于這些miRNA的研究進(jìn)展進(jìn)行綜合分析，選取一些最有可能與衣原體感染相關(guān)的miRNA作為后續(xù)研究的候選者。最后

3、針對(duì)這些候選的miRNA，根據(jù)其參與的生長(zhǎng)調(diào)控，凋亡等不同機(jī)制，在衣原體感染這個(gè)模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)ASO技術(shù)封閉其功能;而后選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)對(duì)一些細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)，如細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、Hoechst法凋亡檢測(cè)等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，以此來(lái)評(píng)估這些miRNA在衣原體感染過(guò)程中所發(fā)揮的作用。
　　[結(jié)果]1.成功建立了E血清型沙眼衣原體的體外細(xì)胞感染模型，并成功的提高了其感染效率。
　　2.通過(guò)miRNA表達(dá)譜芯片這種高通量的篩選方法篩選得到了

4、14個(gè)表達(dá)水平明顯變化的miRNA。其中9個(gè)在感染衣原體的細(xì)胞中表達(dá)水平明顯上調(diào)，5個(gè)表達(dá)水平明顯下調(diào)。
　　3.根據(jù)miRNA表達(dá)譜芯片的結(jié)果提示，發(fā)現(xiàn)通過(guò)人為的封閉表達(dá)水平上升的9個(gè)miRNA的功能，使得沙眼衣原體在感染這種細(xì)胞后最終復(fù)制產(chǎn)生的子代衣原體明顯減少;通過(guò)生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)證明has-miR-190、has-miR-372的低表達(dá)可以明顯的抑制HeLa-229細(xì)胞的分裂增殖。由此推斷沙眼衣原體感染后通過(guò)改變這兩個(gè)miRN

5、A的表達(dá)水平對(duì)宿主細(xì)胞的分裂增殖活性產(chǎn)生影響，最后通過(guò)Hoechst凋亡檢測(cè)證實(shí)了has-miR-15、has-miR-16同時(shí)參與了衣原體感染后所誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡過(guò)程，并發(fā)揮著明顯的作用。
　　[結(jié)論]沙眼衣原體感染宿主細(xì)胞后對(duì)宿主細(xì)胞中多個(gè)miRNA的表達(dá)水平產(chǎn)生影響，而這些miRNA在衣原體感染和復(fù)制中發(fā)揮著明顯的作用，尤其是has-miR-190、has-miR-372、has-miR-15a、has-miR-16分別通