沙眼衣原體感染后HeLa-229細胞的miRNA差異表達及其功能研究.pdf

1、[目的]miRNA是近些年來新發(fā)現(xiàn)的一類能夠調(diào)控其靶基因表達水平的小分子RNA家族。目前，miRNA的功能研究主要集中于生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細胞增殖、細胞凋亡等方面，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miRNA參與了病毒和細菌這些病原微生物與宿主細胞的相互作用過程。本研究的初衷在于進一步探索miRNA在微生物感染宿主細胞過程中所發(fā)揮的作用及其調(diào)控機制，拓展我們關(guān)于miRNA功能的認識。
　　[方法]首先在本實驗室建立沙眼衣原體的體外培養(yǎng)模型

2、，使用HeLa-229作為宿主細胞培養(yǎng)擴增沙眼衣原體。并通過方法的改進提高了衣原體感染宿主細胞的效率，使絕大多數(shù)細胞都被沙眼衣原體感染，為之后的miRNA表達譜芯片實驗提供更好的基礎，而后使用miRNA表達譜芯片檢測沙眼衣原體感染宿主細胞后，細胞中各個miRNA的表達水平的變化。從中篩選表達水平變化最為顯著的一些，并結(jié)合已有的關(guān)于這些miRNA的研究進展進行綜合分析，選取一些最有可能與衣原體感染相關(guān)的miRNA作為后續(xù)研究的候選者。最后

3、針對這些候選的miRNA，根據(jù)其參與的生長調(diào)控，凋亡等不同機制，在衣原體感染這個模型的基礎上，通過ASO技術(shù)封閉其功能;而后選擇適當?shù)膶嶒瀸σ恍┘毎飳W指標，如細胞生長曲線、Hoechst法凋亡檢測等指標進行檢測，以此來評估這些miRNA在衣原體感染過程中所發(fā)揮的作用。
　　[結(jié)果]1.成功建立了E血清型沙眼衣原體的體外細胞感染模型，并成功的提高了其感染效率。
　　2.通過miRNA表達譜芯片這種高通量的篩選方法篩選得到了

4、14個表達水平明顯變化的miRNA。其中9個在感染衣原體的細胞中表達水平明顯上調(diào)，5個表達水平明顯下調(diào)。
　　3.根據(jù)miRNA表達譜芯片的結(jié)果提示，發(fā)現(xiàn)通過人為的封閉表達水平上升的9個miRNA的功能，使得沙眼衣原體在感染這種細胞后最終復制產(chǎn)生的子代衣原體明顯減少;通過生長曲線實驗證明has-miR-190、has-miR-372的低表達可以明顯的抑制HeLa-229細胞的分裂增殖。由此推斷沙眼衣原體感染后通過改變這兩個miRN

5、A的表達水平對宿主細胞的分裂增殖活性產(chǎn)生影響，最后通過Hoechst凋亡檢測證實了has-miR-15、has-miR-16同時參與了衣原體感染后所誘導的宿主細胞凋亡過程，并發(fā)揮著明顯的作用。
　　[結(jié)論]沙眼衣原體感染宿主細胞后對宿主細胞中多個miRNA的表達水平產(chǎn)生影響，而這些miRNA在衣原體感染和復制中發(fā)揮著明顯的作用，尤其是has-miR-190、has-miR-372、has-miR-15a、has-miR-16分別通