衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1的分段克隆表達(dá)及其與沙眼衣原體相互作用的功能區(qū)域初探.pdf

1、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,CT)是一種較常見(jiàn)性傳播疾病(Sexually transmitted disease,STD)病原體。沙眼衣原體感染后，患者會(huì)出現(xiàn)一系列的臨床癥狀，例如宮頸炎、陰道炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、非淋菌性尿道炎、前列腺炎、Reiter綜合征、性病性淋巴肉芽腫等[1,2]。若感染沙眼衣原體后不積極治療，則可能導(dǎo)致女性患者出現(xiàn)自然流產(chǎn)、胎膜早破、異位妊娠、早產(chǎn)和輸卵管性不孕等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生

2、。而且長(zhǎng)期、反復(fù)的沙眼衣原體感染可能增加女性患者宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌、艾滋病感染的危險(xiǎn)性[3]。2001年，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道，世界上每年有新增沙眼衣原體感染病例約9200萬(wàn)例，其中有70％女性患者及50%男性患者為無(wú)癥狀感染者，而實(shí)際的感染者遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出此統(tǒng)計(jì)數(shù)字[4]。美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心（CDC）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：從2007年-2012年，在青中年人群中沙眼衣原體的感染率達(dá)到1.7%[5]。沙眼衣原體感染已經(jīng)成為美國(guó)最為常見(jiàn)的

3、性傳播疾病，發(fā)病率較高，每年新增感染者大于140萬(wàn)[6]。并且，女性患者發(fā)病率高于男性患者[7]。泌尿生殖道沙眼衣原體感染已經(jīng)成為最常見(jiàn)的性傳播疾病之一。泌尿生殖道沙眼衣原體感染嚴(yán)重的危害了人類(lèi)的健康，如何更好的治療該疾病，已經(jīng)成為了較為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。近些年來(lái)，由于抗生素的濫用，耐藥菌感染率不斷增加，使抗生素在細(xì)菌感染性疾病中的應(yīng)用遇到了瓶頸。臨床中，衣原體的治療也遇到了同樣的難題。而衣原體噬菌體對(duì)衣原體的天然殺傷作用為衣原體感染

4、性疾病的控制及治療提供了良好的發(fā)展前景，可以利用衣原體噬菌體作為一種生物制劑來(lái)治療沙眼衣原體的感染。但在此之前，我們需要進(jìn)一步的確定衣原體噬菌體與衣原體的相互作用區(qū)域，以便更好的了解兩者間的相互作用機(jī)制。
　　衣原體噬菌體具有三種主要結(jié)構(gòu)蛋白，包括Vp1，Vp2和Vp3。Vp1是主要的并且是最大的衣原體噬菌體衣殼蛋白，一些研究顯示 Vp1可能是衣原體噬菌體識(shí)別粘附宿主的功能區(qū)域[8,9]。對(duì)Vp1氨基酸序列的分析顯示在其氨基酸序列

5、216-299和462-467間存在兩個(gè)明顯的不同區(qū)域[8]。其中較大的被稱(chēng)為IN5環(huán)，研究者預(yù)測(cè)它暴露在病毒表面并在其表面形成蕈樣突起。較小的區(qū)域被稱(chēng)為INS，也考慮是暴露在病毒表面，而且預(yù)測(cè)其與IN5環(huán)位置極為貼近并相互作用[9]。在衣原體噬菌體 Vp1序列的差異主要是指區(qū)域： IN5和 INS。這表明 IN5和 INS區(qū)域參與受體的識(shí)別。硅片分析證實(shí)兩個(gè)區(qū)域彼此相鄰，這表明它們?cè)跊Q定不同衣原體噬菌體的宿主范圍和組織嗜性中起主要作用

6、[10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)衣殼蛋白Vp1對(duì)沙眼衣原體具有抑制其生長(zhǎng)的作用[11]，而且作用效果顯著。本研究通過(guò)進(jìn)一步縮小衣原體衣殼蛋白 Vp1的表達(dá)片段，來(lái)尋找衣原體噬菌體與衣原體相互作用的功能區(qū)域。
　　[目的]將衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1分段克隆表達(dá)，初步確定衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1與沙眼衣原體相互作用的功能區(qū)域。
　　[方法]通過(guò)I-TASSER、PredictProtien等蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分

7、析網(wǎng)站對(duì)衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1的空間結(jié)構(gòu)及其與沙眼衣原體相互作用的功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果以及研究背景，將衣殼蛋白 Vp1分為不同的部分進(jìn)行表達(dá)，通過(guò) TA克隆技術(shù)克隆表達(dá)目的蛋白，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western-blot免疫印跡技術(shù)對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定，再通過(guò)氯化鉀膠回收法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，并進(jìn)行蛋白定量。將目的蛋白分別作用于沙眼衣原體 E型標(biāo)準(zhǔn)株，觀(guān)察并分析衣殼蛋白Vp1全長(zhǎng)及兩個(gè)蛋白片段分別對(duì)沙

8、眼衣原體E型標(biāo)準(zhǔn)株的抑制作用，并進(jìn)行比較分析。
　　[結(jié)果]根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果及相關(guān)背景資料將衣殼蛋白 Vp1分為 Vp11-189和Vp1190-502兩部分，目的蛋白Vp11-189和Vp1190-502的基因序列長(zhǎng)度分別為567bp和939bp，通過(guò) SDS-PAGE以及 Western-blot鑒定結(jié)果顯示蛋白 Vp11-189和Vp1190-502的相對(duì)分子質(zhì)量分別為20KD和35KD，并且獲得了純化的蛋白Vp11-189和V

9、p1190-502。同時(shí)，體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蛋白Vp11-189、Vp1190-502及Vp1對(duì)沙眼衣原體均有抑制作用，且抑制率分別為43.95%、81.74%和78.02%。
　　[結(jié)論]成功將phiCPG1衣殼蛋白Vp1分為Vp11-189、Vp1190-502兩部分進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)證明，蛋白Vp1190-502與衣殼蛋白Vp1對(duì)沙眼衣原體E型標(biāo)準(zhǔn)株具有相似的抑制作用，并且作用效果顯著。蛋白 Vp1的190-502