衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1的原核表達及提純研究.pdf

1、沙眼衣原體(Ct)是目前國內(nèi)外最常見的性病病原體之一，也是非淋球菌性尿道炎(NGU)的主要病原體。泌尿生殖道Ct感染的發(fā)病率在我國有逐年增加的趨勢，耐藥性日益嚴重，已成為危害公共健康的一大問題。噬菌體(phage)是一群能特異地感染宿主細菌并將其裂解的病毒，它不僅在分子生物學研究中起重要作用，作為抗菌劑治療細菌感染正日益受到重視。衣原體噬菌體是微病毒，目前只是在肺炎衣原體、感染流產(chǎn)衣原體、魚類衣原體等數(shù)種衣原體種發(fā)現(xiàn)有噬菌體的存在，研究

2、顯示組成衣原體噬菌體殼的衣殼蛋白主要成分是Vp1、vp2和Vp3，其中Vp1是最主要的結構蛋白，這三種蛋白在噬菌體對衣原體的黏附和殖入中可能有重要作用。同時該蛋白高度保守而特異，因而是在其它衣原體種…尤其是沙眼衣原體尋找衣原體噬菌體的良好標志物。本課題旨在對Vp1蛋白進行分離和純化，為下一步研究該蛋白的免疫原性、Vp1．蛋白單克隆抗體制備及Vp1蛋白與衣原體作用的相關機制奠定基礎。并通過純化的Vp1蛋白和由此得到的vp1．抗體進行臨床篩

3、查，試圖發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體噬菌體——其潛在的臨床價值令人期待。 目的：對衣原體GPIC噬菌體衣殼蛋白VP1蛋白進行表達、純化和鑒定。 方法：將帶有vp1基因-pET30a(+)的大腸桿菌BL21進行卡那霉素抗生素平板篩選后，挑取生長的單菌落培養(yǎng)至對數(shù)生長期并提取重組質粒，限制性核酸內(nèi)切酶BamHI單酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。重組質粒長度與理論長度相近后，重組質粒測序，應用核酸分析軟件比對vp1基因測序結果和Geneb

4、ank提供的vpl基因序列的同源性。IPTG誘導上述大腸桿菌BL21表達融合蛋白。細菌裂解物離心的上清和沉淀分別行SDS-PAGE電泳，分析融合蛋白的表達形式。不溶性(包涵體)表達的融合蛋白帶有組氨酸標簽，以抗組氨酸標簽抗體為一抗，Western blot技術鑒定融合蛋白。優(yōu)化IPTG濃度和誘導時間后大量表達蛋白，以含6M脲的結合緩沖液溶解細菌裂解物離心沉淀，經(jīng)0.45um孔徑濾器過濾后上純化柱結合，按變性條件下洗脫步驟分步洗脫并優(yōu)化洗

5、脫條件，SDS-PAGE電泳分析洗脫樣品。收集電泳條帶單一的洗脫樣品透析復性，考馬斯亮藍法對蛋白進行定量。并以Vp1多克隆抗體為一抗，Western blot方法鑒定Vp1蛋白的抗原性。 結果：單酶切重組質?？梢娫诩s8000bp處有單一DNA條帶，質粒測序后比對結果示同源性為99.46％，為同義突變，氨基酸序列同源性為100％，重組質粒構建正確。經(jīng)IPTG誘導表達，SDS-PAGE電泳和Western Blot顯示從細菌裂解物離

6、心沉淀中能獲得約70kD的衣原體GPIC噬菌體衣殼蛋白Vp1，細菌裂解物上清電泳未發(fā)現(xiàn)目的蛋白。誘導條件優(yōu)化后，證實采取37℃、0.03IllM IPTG及誘導2小時為最適誘導條件。6M脲的結合緩沖液能很好溶解離心沉淀，經(jīng)0.45um孔徑濾器過濾后溶液清亮，上柱后未出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象。提純過程中增加結合緩沖液洗滌次數(shù)后，洗脫早期即得到單一蛋白電泳條帶的洗脫樣品。蛋白定量為126.3ug/ml。透析復性后以Vp1多克隆抗體為一抗Western