衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1的原核表達(dá)及提純研究.pdf

1、沙眼衣原體(Ct)是目前國(guó)內(nèi)外最常見的性病病原體之一，也是非淋球菌性尿道炎(NGU)的主要病原體。泌尿生殖道Ct感染的發(fā)病率在我國(guó)有逐年增加的趨勢(shì)，耐藥性日益嚴(yán)重，已成為危害公共健康的一大問題。噬菌體(phage)是一群能特異地感染宿主細(xì)菌并將其裂解的病毒，它不僅在分子生物學(xué)研究中起重要作用，作為抗菌劑治療細(xì)菌感染正日益受到重視。衣原體噬菌體是微病毒，目前只是在肺炎衣原體、感染流產(chǎn)衣原體、魚類衣原體等數(shù)種衣原體種發(fā)現(xiàn)有噬菌體的存在，研究

2、顯示組成衣原體噬菌體殼的衣殼蛋白主要成分是Vp1、vp2和Vp3，其中Vp1是最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，這三種蛋白在噬菌體對(duì)衣原體的黏附和殖入中可能有重要作用。同時(shí)該蛋白高度保守而特異，因而是在其它衣原體種…尤其是沙眼衣原體尋找衣原體噬菌體的良好標(biāo)志物。本課題旨在對(duì)Vp1蛋白進(jìn)行分離和純化，為下一步研究該蛋白的免疫原性、Vp1．蛋白單克隆抗體制備及Vp1蛋白與衣原體作用的相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。并通過純化的Vp1蛋白和由此得到的vp1．抗體進(jìn)行臨床篩

3、查，試圖發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體噬菌體——其潛在的臨床價(jià)值令人期待。 目的：對(duì)衣原體GPIC噬菌體衣殼蛋白VP1蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化和鑒定。 方法：將帶有vp1基因-pET30a(+)的大腸桿菌BL21進(jìn)行卡那霉素抗生素平板篩選后，挑取生長(zhǎng)的單菌落培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并提取重組質(zhì)粒，限制性核酸內(nèi)切酶BamHI單酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。重組質(zhì)粒長(zhǎng)度與理論長(zhǎng)度相近后，重組質(zhì)粒測(cè)序，應(yīng)用核酸分析軟件比對(duì)vp1基因測(cè)序結(jié)果和Geneb

4、ank提供的vpl基因序列的同源性。IPTG誘導(dǎo)上述大腸桿菌BL21表達(dá)融合蛋白。細(xì)菌裂解物離心的上清和沉淀分別行SDS-PAGE電泳，分析融合蛋白的表達(dá)形式。不溶性(包涵體)表達(dá)的融合蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，以抗組氨酸標(biāo)簽抗體為一抗，Western blot技術(shù)鑒定融合蛋白。優(yōu)化IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間后大量表達(dá)蛋白，以含6M脲的結(jié)合緩沖液溶解細(xì)菌裂解物離心沉淀，經(jīng)0.45um孔徑濾器過濾后上純化柱結(jié)合，按變性條件下洗脫步驟分步洗脫并優(yōu)化洗

5、脫條件，SDS-PAGE電泳分析洗脫樣品。收集電泳條帶單一的洗脫樣品透析復(fù)性，考馬斯亮藍(lán)法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。并以Vp1多克隆抗體為一抗，Western blot方法鑒定Vp1蛋白的抗原性。 結(jié)果：?jiǎn)蚊盖兄亟M質(zhì)粒可見在約8000bp處有單一DNA條帶，質(zhì)粒測(cè)序后比對(duì)結(jié)果示同源性為99.46％，為同義突變，氨基酸序列同源性為100％，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳和Western Blot顯示從細(xì)菌裂解物離

6、心沉淀中能獲得約70kD的衣原體GPIC噬菌體衣殼蛋白Vp1，細(xì)菌裂解物上清電泳未發(fā)現(xiàn)目的蛋白。誘導(dǎo)條件優(yōu)化后，證實(shí)采取37℃、0.03IllM IPTG及誘導(dǎo)2小時(shí)為最適誘導(dǎo)條件。6M脲的結(jié)合緩沖液能很好溶解離心沉淀，經(jīng)0.45um孔徑濾器過濾后溶液清亮，上柱后未出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象。提純過程中增加結(jié)合緩沖液洗滌次數(shù)后，洗脫早期即得到單一蛋白電泳條帶的洗脫樣品。蛋白定量為126.3ug/ml。透析復(fù)性后以Vp1多克隆抗體為一抗Western