衣原體噬菌體PhiCPG1衣殼蛋白Vp1對(duì)沙眼衣原體作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　探究Vp1蛋白作用于沙眼衣原體并抑制其生長(zhǎng)的機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　研究 Vp1蛋白作用于沙眼衣原體后的光鏡下及免疫熒光鏡下的變化；研究Vp1蛋白作用于沙眼衣原體后不同時(shí)間點(diǎn)MEK/ERK通路p-ERK1/2蛋白的改變， ERK1和ERK2基因的改變，IL-1和IL-8炎性因子的改變；研究Vp1蛋白與阿奇霉素作用于沙眼衣原體后的區(qū)別與聯(lián)系；研究 Vp1蛋白作用于沙眼衣原體后三型分泌系統(tǒng)的改變；研究V

2、p1蛋白作用于沙眼衣原體后對(duì)其生長(zhǎng)周期的影響。
　　研究方法：
　　對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒菌Vp1-Pet30a（+）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)出的Vp1蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western Blot鑒定并純化，純化后的Vp1蛋白透析復(fù)性后進(jìn)行蛋白定量、濾過(guò)除菌后使用。將處理后的 Vp1和阿奇霉素與沙眼衣原體在 McCoy細(xì)胞中作用，在光鏡下及免疫熒光鏡下觀察兩者對(duì)沙眼衣原體的抑制作用；提取各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的總蛋白，采用Wes

3、tern Blot方法檢測(cè)各組之間ERK信號(hào)通路p-ERK1/2及總ERK1/2的變化情況；提取各組細(xì)胞的總RNA，采用Realtime-PCR方法檢測(cè)各組之間ERK1及ERK2基因的變化情況；提取各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)液上清，用ELISA方法檢測(cè)各組IL-1及IL-8的表達(dá)水平。
　　應(yīng)用純化無(wú)菌的Vp1在McCoy細(xì)胞中作用于沙眼衣原體，同時(shí)設(shè)置未干預(yù)組和空白作為對(duì)照。培養(yǎng)12h、24h、36h、48h后，分別提取各組細(xì)胞的

4、總RNA，應(yīng)用Realtime-PCR方法檢測(cè)沙眼衣原體內(nèi)Tarp（CT456）、CT694、IncA（CT119）、TepP（CT875）、CT621、Cdsf（CT666）、HctA（CT743）、HctB（CT046）、OmcA（CT444）、 OmcB（CT443）基因在不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)前后表達(dá)的不同。
　　研究結(jié)果：
　　1、重組表達(dá)的Vp1及阿奇霉素對(duì)McCoy細(xì)胞內(nèi)正常生長(zhǎng)的沙眼衣原體均有抑制作用，光鏡下及熒光顯

5、微鏡下觀察到包涵體減少，并且其減少的程度與Vp1的及阿奇霉素的濃度呈正相關(guān)。Vp1作用于沙眼衣原體后可與其結(jié)合并跟隨其進(jìn)行復(fù)制。2、Vp1及阿奇霉素作用于沙眼衣原體后均可引起McCoy細(xì)胞內(nèi)MEK/ERK通路的改變，p-ERK1/2表達(dá)減少，ERK1及ERK2基因表達(dá)降低，尤以ERK1下降為顯著。3、從Vp1與阿奇霉素起作用的時(shí)間來(lái)看，Vp1對(duì)沙眼衣原體的抑制作用主要發(fā)生于衣原體生長(zhǎng)周期的后期，而阿奇霉素對(duì)沙眼衣原體的抑制作用主要發(fā)生于

6、衣原體生長(zhǎng)周期的早期。4、Vp1及阿奇霉素作用于沙眼衣原體后，McCoy細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子IL-1及IL-8減少，細(xì)胞炎癥減輕。作用后，IL-1在感染后期減少明顯；IL-8在Vp1干預(yù)后早期即有減少，阿奇霉素干預(yù)后感染后期減少明顯。5、Vp1作用于沙眼衣原體后可導(dǎo)致沙眼衣原體內(nèi)三型分泌系統(tǒng)分泌減弱。感染早期（EB侵入宿主細(xì)胞），Cdsf（CT666）表達(dá)下調(diào)，使EB對(duì)宿主細(xì)胞的感染能力下降。感染后期（即RB轉(zhuǎn)為EB時(shí)期），Tarp（CT

7、456）、CT694表達(dá)水平降低，衣原體的侵襲能力下降。IncA（CT119）表達(dá)水平上升，衣原體同型融合增多，RB不斷融合形成異常增大的網(wǎng)狀體。Cdsf（CT666）、CT621表達(dá)下調(diào)，可使RB轉(zhuǎn)化為EB減少。TepP（CT875）在整個(gè)生長(zhǎng)周期中表達(dá)水平均降低，提示 Vp1可能干預(yù)衣原體與宿主細(xì)胞之間的信號(hào)通路傳遞，干擾包涵體形成。其可能還參與免疫相關(guān)基因的調(diào)控，使宿主細(xì)胞對(duì)衣原體的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，從而達(dá)到抑制衣原體生長(zhǎng)的目的。6、

8、Vp1作用于沙眼衣原體后，可導(dǎo)致沙眼衣原體生長(zhǎng)周期晚期表達(dá)的基因水平下調(diào)。HctA（CT743）、HctB（CT046）、OmcA（CT444）、OmcB（CT443）在 Vp1作用于沙眼衣原體后的晚期表達(dá)均較為干預(yù)組有所下降，提示 Vp1可能通過(guò)某種機(jī)制抑制了沙眼衣原體生長(zhǎng)周期晚期表達(dá)的基因，從而影響RB向EB的轉(zhuǎn)化，抑制沙眼衣原體的增殖。
　　結(jié)論：
　　Vp1蛋白可能通過(guò)干擾沙眼衣原體生長(zhǎng)的后期RB轉(zhuǎn)化為EB過(guò)程來(lái)抑制