沙眼衣原體質(zhì)粒致病機(jī)制分析.pdf

1、第一部分沙眼衣原體質(zhì)粒編碼蛋白的表達(dá)和相互作用的分析
　　目的：分析沙眼衣原體質(zhì)粒編碼蛋白的相互作用。
　　方法：采用基因克隆的方法將沙眼衣原體質(zhì)?；騊gp1-4及Pgp8分別克隆到pRAC和pRBR上，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)分析蛋白相互作用。
　　結(jié)果：Western blot結(jié)果顯示Pgp1、Pgp3與大腸桿菌RpoA氨基末端功能區(qū)（α-NTD）融合蛋白及 Pgp1、Pgp3、Pgp4與 DNA結(jié)合蛋白λCI

2、融合蛋白，能在大腸桿菌中表達(dá)。在報(bào)告菌株中，共表達(dá)與α-NTD融合的Pgp3蛋白（α- Pgp3）及與λCI融合的Pgp3蛋白（CI-Pgp3），導(dǎo)致報(bào)告基因產(chǎn)物β-半乳糖苷酶的活性升高。而余無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：Pgp3編碼的Pgp3能與自身相互作用。
　　第二部分沙眼衣原體質(zhì)粒編碼蛋白Pgp3和Pgp4致病作用分析
　　目的：探究沙眼衣原體質(zhì)粒編碼蛋白Pgp3及Pgp4的致病作用。
　　方法：用轉(zhuǎn)化菌株L2

3、GFP△Pgp3、L2GFP△Pgp4、L2GFP和野生菌株L2及不含質(zhì)粒菌株L2建立HeLa229細(xì)胞感染模型，分別對(duì)各菌株進(jìn)行經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證，Titration測(cè)定IFUs繪制生長(zhǎng)曲線，激光共聚焦觀察不同感染時(shí)間點(diǎn)包涵體形態(tài)，Western Blotting檢測(cè)主要外膜蛋白（MOMP）表達(dá)量，糖原定量試劑盒測(cè)定HeLa細(xì)胞糖原含量，SEAP Quanti-Blue檢測(cè)TLR2和NF-κB信號(hào)通路的激活情況。
　　結(jié)果：菌落P

4、CR驗(yàn)證各菌株均正確；衣原體表型分析結(jié)果顯示：質(zhì)粒及其編碼蛋白Pgp4不影響衣原體繁殖（P＞0.05），但缺失突變后可使包涵體內(nèi)容物在感染早期提前釋放，感染后期內(nèi)容物減少?gòu)亩绊懓w形態(tài)；Western blotting、糖原定量、SEAP Quanti-Blue結(jié)果顯示：與野生菌株相比，L2GFP△Pgp4 MOMP的表達(dá)量較高（P＜0.001），糖原累積能力及激活TLR2及NF-κB信號(hào)通路能力較弱（P＜0.001）。與Pgp4相