衣原體質(zhì)粒侵襲細(xì)胞相關(guān)毒力基因的體外鑒定.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化沙眼衣原體鼠肺炎株（MoPn）。比較幾種轉(zhuǎn)化MoPn菌株在體外培養(yǎng)中對宿主細(xì)胞的感染力，鑒定與衣原體質(zhì)粒侵襲細(xì)胞相關(guān)的毒力基因，并比較不同實(shí)驗(yàn)條件對衣原體侵襲和粘附宿主細(xì)胞能力的影響；鑒定影響衣原體在宿主細(xì)胞與細(xì)胞間傳播和生長能力和導(dǎo)致包涵體內(nèi)糖原合成障礙相關(guān)的基因。
　　方法：選取Hela細(xì)胞為宿主細(xì)胞，將攜帶敲除了衣原體質(zhì)粒中不同開放閱讀框（ORF）的各轉(zhuǎn)化菌株接種培養(yǎng)20～24h,復(fù)蘇成功后不斷擴(kuò)增

2、收集。采用泛影鈉-泛影葡胺密度梯度離心法進(jìn)行菌株的純化；測定各菌株濃度，按相同的菌量接種，設(shè)定離心+二乙胺乙基葡聚糖(DEAE-D)、離心、DEAE-D、無任何處理四個接種條件，在不同的實(shí)驗(yàn)條件下分別對各菌株進(jìn)行處理，利用間接免疫熒光顯微鏡計數(shù)包涵體數(shù)目；分別于（20、40、60 h）觀察各菌株連續(xù)3代感染細(xì)胞后菌斑形成的速度與面積大??；采用Lugol碘液染色，在倒置顯微鏡下，觀察各菌株包涵體內(nèi)糖原的合成情況。
　　結(jié)果：純化后獲

3、得了高感染活性的沙眼衣原體原體（EB）。敲除質(zhì)粒編碼蛋白Pgp4的菌株pGFP::CMΔPgp4在4種條件下包涵體數(shù)目分別為（10.20±1.30）、（6.80±0.44）、（3.00±1.22）和（0.80±0.45）個，陰性對照組質(zhì)粒缺失株CMUT3包涵體數(shù)目分別為（6.40±0.89）、（3.80±0.83）、（1.60±0.89）和（0.60±0.54）個，同一條件下兩者均表現(xiàn)出相近的感染能力，包涵體數(shù)目均低于同一條件下其他菌株

4、（均P<0.01）；同一菌株在不同條件下，包涵體數(shù)目差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=845.310，P<0.01）；各菌株在離心+DEAE-D條件下包涵體數(shù)目最多；菌株pGFP::CMΔPgp4和質(zhì)粒缺失株連續(xù)3代感染細(xì)胞時菌斑形成的速度和面積大小均低于其他菌株；并出現(xiàn)糖原累積的障礙。
　　結(jié)論：超速低溫密度梯度離心純化能夠去除細(xì)胞中其它細(xì)胞成分對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，較既往常規(guī)的純化方法更能保證結(jié)果的可靠性。Pgp4是衣原體質(zhì)粒侵襲細(xì)胞相關(guān)的