木本植物黃化類植原體的檢測鑒定及苦楝叢枝植原體質(zhì)粒的測定.pdf

1、中國植物種類資源豐富，植原體病害頻發(fā)，過去被認(rèn)為由生理性病害造成的許多黃化類病害目前已發(fā)現(xiàn)是由植原體引起，有些植原體病害已給林木生產(chǎn)和林業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來很大的危害和損失。木本植物黃化類植原體病害與典型的叢枝類植原體病害的很大不同是在被侵染組織內(nèi)的植原體含量低，給該類植原體的檢測鑒定帶來了很大困難。通過對黃化類病害的調(diào)查、植原體的準(zhǔn)確檢測及鑒定，從而準(zhǔn)確地診斷病害、制定更有針對性的防治措施進(jìn)而有效的控制此類病害，對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

2、>　　本研究采集了北京、四川成都等地的桃樹黃化及其它木本黃化類病害樣品，用改進(jìn)的植物總DNA的提取方法，包括利用天根植物基因組試劑盒CB3吸附柱，獲得了純度較高的總DNA；用植原體16Sr DNA通用引物R16mF2/R16mR1未擴(kuò)增到目的片段，進(jìn)一步用巢式通用引物R16F2/R16R2從北京頤和園桃樹黃化、北京懷柔桃樹黃化及北京植物園鼠李黃化病樣中檢測到植原體的存在，PCR產(chǎn)物序列分析表明他們都屬于16Sr I組并和泡桐叢枝植原體有

3、極高的同源性。當(dāng)用植原體等滲液和差速離心法，先富集植原體，然后提取DNA用于檢測時，從懷柔桃樹黃化病樣中直接擴(kuò)增到較弱的1.4kb條帶，可以確定其被植原體侵染。把黃化桃樹接穗嫁接到健康桃樹砧木上，未觀察到砧木出現(xiàn)典型的葉片黃化癥狀；嫁接35天和90天后，利用巢式PCR方法也未檢測到砧木中存在植原體，而利用帶病櫻桃組培苗芽嫁接盆栽健康櫻桃，成功地將櫻桃致死黃化（CLY）植原體傳染到健康櫻桃中；利用PCR的方法檢測了被嫁接櫻桃中不同時期、不

4、同部位植原體的分布情況，并利用TaqMan實時定量熒光PCR技術(shù)比較測定了被嫁接櫻桃樹砧木不同部位、組培接穗葉片及根部及田間采集的櫻桃致死黃化葉片中的植原體含量，結(jié)果表明：離嫁接病芽部位最近的新萌發(fā)腋芽、田間病葉、組培苗枝葉和根部都檢測到植原體的存在，嫁接部位同側(cè)細(xì)根也可能感染植原體，但濃度可能很低，而其他部位皆未檢測到植原體存在，其中，離病接穗最近的一個砧木萌芽部位的植原體濃度最高，其次為病組培苗，再次為田間樣品，表明新發(fā)病的表現(xiàn)嚴(yán)重

5、小葉皺縮癥狀部位的植原體濃度較高，而組織培養(yǎng)法是保存和繁殖CLY植原體的良好途徑。
　　本研究對河南濮陽高新區(qū)東干城和小王堌兩桃園發(fā)生的桃樹黃化病進(jìn)行了調(diào)查、采樣檢測和輸液治療試驗，綜合植物營養(yǎng)素、四環(huán)素治療情況，兩次采樣PCR檢測結(jié)果和果農(nóng)施肥及施用多效唑等情況，我們分析和判斷東干城桃樹黃化不是由植原體導(dǎo)致的，很可能是因桃樹體內(nèi)缺少一些營養(yǎng)元素造成的。小王堌桃樹黃化病因和東干城桃樹黃化病因類似，主要是樹體內(nèi)缺少營養(yǎng)元素（比如缺鐵

6、等）造成的，一些桃樹植株內(nèi)也存在的少量病原植原體，但可能不是導(dǎo)致小王堌桃樹黃化病害的主要原因。
　　本研究用pPaWBNy-1 ORF4抗血清檢測了幾種不同植原體侵染的植物材料，Western blot結(jié)果表明，在叢枝泡桐中檢測到大小為34 KDa的特異性目的條帶，并在叢枝泡桐和健康泡桐中檢測到一條90 KDa較弱的非特異性條帶，該條帶可能是和寄主泡桐中的蛋白產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)，海南綠變長春花中檢測到兩條分別為49 KDa和45

7、KDa、棗瘋病材料中檢測到45KDa很弱的非特異性條帶，板栗黃化皺縮、櫻桃致死黃化和其他健康材料中沒有檢測到條帶。
　　本研究首次測定了我國苦楝叢枝植原體中的一個質(zhì)粒pCWBFq的完整DNA序列，生物信息學(xué)軟件預(yù)測pCWBFq編碼6個蛋白，除了與質(zhì)粒復(fù)制有關(guān)的RepA和SSB外，另外4個均為含有疏水結(jié)構(gòu)的分泌蛋白或膜蛋白。對已測定的25個植原體質(zhì)粒的DNA序列進(jìn)行相似性比對，結(jié)果表明pCWBFq和pPaWBNy-1的相似性最高，為

8、71.02％。對質(zhì)粒編碼的蛋白進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示6個蛋白與來自不同植原體質(zhì)粒編碼的蛋白均具有較高的序列相似性，與pCWBFq P2序列相似性較高的蛋白質(zhì)并非都是由植原體染色質(zhì)外DNA編碼的，如：AYWB404是由翠菊黃化叢枝植原體染色質(zhì)DNA編碼的，和pCWBFq P2相似性達(dá)91.9%?；谫|(zhì)粒DNA全序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，pCWBFq與其他16SrI組的質(zhì)粒聚為一個大的分支，結(jié)果與根據(jù)16Sr DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致

9、。分別對6個ORF的核酸及編碼蛋白氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示RepA的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果與基于16S rDNA序列和質(zhì)粒DNA全序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果不一致，不能很好的區(qū)分現(xiàn)有的16S組，而ORF2-ORF6的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果與16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果大體吻合，其中基于 ORF3的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果與基于質(zhì)粒完整序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果的一致性較好。
　　用pCWBFq Rep基因序列為模板制備探針進(jìn)行Southe