沙門菌質(zhì)粒和毒力基因?qū)?xì)胞自噬的影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過(guò)建立沙門菌感染的細(xì)胞模型，觀察傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98及與其密切相關(guān)的沙門菌質(zhì)粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene B，spvB)對(duì)自噬及感染結(jié)局的影響，探討其發(fā)生機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路，以期揭示沙門菌質(zhì)粒毒力基因增強(qiáng)宿主菌毒力的分子機(jī)制，為探索通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬水平控制沙門菌感染的新途徑，并為后續(xù)新藥靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及疫苗開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.沙門菌

2、質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞自噬及感染結(jié)局的影響。以攜帶質(zhì)粒pRST98的傷寒沙門菌(Salmonella typhi，S.typhi)野生株ST8為實(shí)驗(yàn)株，消除pRST98的突變株ST8-△pRST98為陰性對(duì)照株，攜帶沙門菌質(zhì)粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene，spv)的鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)毒株(Salmonella typhimurium)SR-11為陽(yáng)性對(duì)照株，將受試菌與野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(wide

3、type mouse embryonic fibroblasts，WT-MEFs)及自噬基因5缺陷型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(autophagy associated gene5deficient mouse embryonic fibroblasts，Atg5-/-MEFs)體外共培養(yǎng)，制作細(xì)胞感染模型。以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為100:1感染細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立WT-MEFs的自噬

4、激動(dòng)劑--雷帕霉素(rapamycin，RAPA)干預(yù)組。將細(xì)胞與細(xì)菌共作用1 h后吸取上清，此時(shí)定為“0”點(diǎn)，加入含有100μg/ml的阿米卡星(Amikacin，AMK)培養(yǎng)液作用2 h以去除胞外菌，然后將AMK濃度降為10μg/ml以抑制從感染細(xì)胞中釋放至培養(yǎng)液中的細(xì)菌生長(zhǎng)。分別在感染的不同時(shí)間段(1 h、3 h、5 h、8 h和10 h)收獲細(xì)胞，采用以下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：①單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin，

5、MDC)染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)點(diǎn)狀自噬囊泡；②透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察細(xì)胞內(nèi)雙層或多層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體；⑨Western Blotting(WB)檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白--微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(Microtubule-associated protein1 light chain3-Ⅱ，MAP1-LC3-Ⅱ，即LC3-Ⅱ)表達(dá)情況；④Annexin.V-FITC/P

6、ropidium Iodide(Ann.V/PI)雙染流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析細(xì)胞凋亡率；⑤梯度稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)胞內(nèi)集落形成單位(colony forming unit，CFU)。
　　 2.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB影響細(xì)胞自噬及機(jī)制研究。以spvB缺陷的鼠傷寒沙門菌SR-11突變株(SR-11-△spvB)及含有spvB的野生型鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)毒株SR-11(SR-11)為研究對(duì)象，將實(shí)驗(yàn)

7、菌株體外感染W(wǎng)T-MEFs及Atg5-/-MEFs，MOI為100:1，細(xì)胞感染過(guò)程同第一部分。分別在感染的不同時(shí)間段(1 h、3 h、5 h、8 h和10 h)收獲細(xì)胞，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：①WB檢測(cè)細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白、磷脂酶D(phospholipase D1--PLDl和phospholipase D2--PLD2)蛋白及Toll樣受體4(Toll-like receptors4，TLR4)蛋白表達(dá)情況；②放射性[9，10-3H]油酸標(biāo)

8、記檢測(cè)感染細(xì)胞的PLD活性；③逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerasechain reaction，RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞TLR4信使RNA(messanger RNA，mRNA)表達(dá)情況；④Ann.V/PI雙染FCM分析細(xì)胞凋亡率；⑤酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子干擾素-γ(Interferon-γ，I

9、FN-γ)及Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)和白細(xì)胞介素-13(interleukin-13，IL-13)的表達(dá)；⑥梯度稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)胞內(nèi)CFU。
　　 結(jié)果：
　　 1.沙門菌質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞自噬及感染結(jié)局的影響
　　 (1)MDC熒光染色結(jié)果：ST8及SR-11感染的各組細(xì)胞中，在感染早期，WT-MEFs內(nèi)可見(jiàn)很少量的點(diǎn)狀自噬囊泡顆粒，RAPA干預(yù)后，WT-MEFs在感

10、染早期1 h點(diǎn)狀自噬囊泡顆粒數(shù)量增多。感染早期1 h，ST8-△pRST98感染的WT-MEFs出現(xiàn)大量的點(diǎn)狀自噬囊泡顆粒，3 h時(shí)顆粒數(shù)量減少，RAPA干預(yù)的ST8-△pRST98感染W(wǎng)T-MEFs在早期亦出現(xiàn)數(shù)量眾多的自噬囊泡顆粒。
　　 (2)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察：在感染早期1 h，ST8及SR-11感染的WT-MEFs內(nèi)未見(jiàn)自噬小體，RAPA干預(yù)后，ST8及SR-11感染的WT-MEFs胞內(nèi)可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體。感染早期

11、1 h，電鏡下可見(jiàn)ST8-△pRST98感染的WT-MEFs及RAPA干預(yù)的WT-MEFs內(nèi)有典型的雙層或多層膜自噬小體。
　　 (3)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)：在感染早期1 h，ST8及SR-11感染W(wǎng)T-MEFs的LC3-Ⅱ表達(dá)較弱，RAPA干預(yù)后，ST8及SR-11感染W(wǎng)T-MEFs的LC3-Ⅱ表達(dá)明顯增強(qiáng)。感染中晚期5 h-10 h，LC3-Ⅱ在上述各組感染細(xì)胞均不表達(dá)。感染早期1 h和3 h，ST8-△pRST98感染的WT

12、-MEFs的LC3-Ⅱ表達(dá)較強(qiáng)，且LC3-Ⅱ在1 h的表達(dá)強(qiáng)度高于3 h；RAPA干預(yù)WT-MEFs后，LC3-Ⅱ表達(dá)明顯增加。
　　 (4)3株細(xì)菌感染的Atg5-/-MEFs在感染各時(shí)間段均沒(méi)有觀察到點(diǎn)狀自噬囊泡顆粒、雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體及LC3-Ⅱ表達(dá)等自噬現(xiàn)象發(fā)生。
　　 (5)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果：ST8感染的各組細(xì)胞中，Atg5-/-MEFs和WT-MEFs之間凋亡率無(wú)顯著性差異，RAPA干預(yù)WT-MEFs后，其

13、凋亡率明顯降低。SR-11感染各組細(xì)胞的凋亡比較結(jié)果與ST8感染細(xì)胞類似，Atg5-/-MEFs和WT-MEFs之間凋亡率無(wú)顯著性差異，在以RAPA干預(yù)后，WT-MEFs凋亡率顯著降低。ST8-△pRST98感染的各組細(xì)胞凋亡結(jié)果分析顯示，在各個(gè)時(shí)間段，Atg5-/-MEFs凋亡率最高，RAPA干預(yù)的WT-MEFs凋亡率高于RAPA未干預(yù)的WT-MEFs凋亡率。
　　 (6)梯度稀釋法計(jì)數(shù)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量：ST8感染的各組細(xì)胞之間，

14、Atg5-/-MEFs和WT-MEFs的胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量無(wú)顯著性差異，而RAPA干預(yù)的WT-MEFs胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著低于RAPA未干預(yù)WT-MEFs組。SR-11感染各組細(xì)胞的胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量比較結(jié)果與ST8感染細(xì)胞類似，Atg5-/-MEFs和WT-MEFs之間無(wú)顯著性差異，RAPA干預(yù)后，WT-MEFs內(nèi)細(xì)菌數(shù)量明顯減少。ST8-△pRST98感染的各組細(xì)胞比較結(jié)果顯示，Atg5-/-MEFs胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量最多，RAPA干預(yù)的WT-MEFs與

15、RAPA未干預(yù)的WT-MEFs之間無(wú)顯著性差異。
　　 2.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB影響細(xì)胞自噬及機(jī)制研究
　　 (1)感染細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)情況：在感染早期1 hSD3 h，SR-11感染W(wǎng)T-MEFs的LC3-Ⅱ表達(dá)明顯弱于SR-11-△spvB感染的WT-MEFs，在感染中后期5h～10 h，LC3-Ⅱ均不表達(dá)。
　　 (2)感染細(xì)胞PLD1和PLD2蛋白表達(dá)情況：在各時(shí)間段，SR-11感染細(xì)胞的PL

16、D1蛋白表達(dá)水平強(qiáng)于SR-11-△spvB感染細(xì)胞，而PLD2蛋白表達(dá)水平在兩株細(xì)菌感染細(xì)胞之間無(wú)顯著性差異。
　　 (3)感染細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)情況：在感染各時(shí)間段，SR-11感染細(xì)胞的TLR4蛋白表達(dá)水平明顯弱于SR-11-△spvB感染細(xì)胞。
　　 (4)感染細(xì)胞PLD活性測(cè)定：SR-11及SR-11-△spvB感染細(xì)胞的PLD活性均明顯高于空白細(xì)胞的PLD基礎(chǔ)活性；在感染各時(shí)間段，SR-11感染細(xì)胞的PLD活性

17、均高于SR-11-△spvB感染細(xì)胞，1 h達(dá)到高峰，以后逐漸下降。
　　 (5)感染細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)情況：在感染各時(shí)間段，SR-11感染細(xì)胞的TLR4mRNA表達(dá)水平低于SR-11-△spvB感染細(xì)胞。
　　 (6)感染細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：在感染各時(shí)間段，SR-11-△spvB感染的WT-MEFs凋亡率顯著低于SR-11感染的WT-MEFs及，SR-11-△spvB感染的Atg5-/-MEFs凋亡率；SR-11感

18、染的WT-MEFs與Atg5-/-MEFs之間，凋亡率無(wú)顯著性差異。
　　 (7)感染細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)情況：感染早期和中期(1 h-5 h)，SR-11感染細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)水平低于SR-11-△spvB感染細(xì)胞組，而SR-11感染細(xì)胞的IL-4及IL-13表達(dá)明顯高于SR-11-△spvB感染細(xì)胞組；在感染后期(8h～10 h)，兩株細(xì)菌感染細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)無(wú)顯著性差異。
　　 (8)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)檢測(cè)：SR-11感

19、染的WT-MEFs及Atg5-/-MEFs之間胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量無(wú)顯著性差異。SR-11-△spvB感染W(wǎng)T-MEFs的胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著低于SR-11-△spvB感染的Atg5-/-MEFs和SR-11感染的WT-MEFs胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)。
　　 結(jié)論：
　　 1.傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98可通過(guò)抑制細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活和增殖，從而加重細(xì)胞損傷。
　　 2.傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98抑制自噬的作用與其基因序列上

20、的重要毒力基因spvB密切相關(guān)。spvB可通過(guò)抑制細(xì)胞TLR4表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞PLD1表達(dá)及增加PLD活性，抑制Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-13表達(dá)從而導(dǎo)致Th1/Th2免疫漂移等途徑抑制細(xì)胞自噬。spvB抑制自噬的信號(hào)通路與絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine protein kinase，AKT)依賴性方式激活TOR激酶(Mammalian Target of Rapamycin，m