自噬紊亂對巨核細(xì)胞發(fā)育的影響和機制的研究.pdf

1、自噬是細(xì)胞降解部分胞漿，長壽命蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器的重要途徑之一。它可以通過重新利用細(xì)胞內(nèi)的組分抵抗外界壓力促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化。自噬在造血干細(xì)胞中的缺失能導(dǎo)致多系血細(xì)胞的異常分化，許多血液病尤其是血小板相關(guān)疾病伴隨著自噬水平的上調(diào)，包括特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）和伴隨血小板減少的骨髓異常增生綜合征（MDS）。因此，近年來人們開始重視自噬影響巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生成的研究工作。為了探究自噬對巨核細(xì)胞成熟及血小板生成的調(diào)節(jié)作用，我們

2、主要利用了體外自噬調(diào)節(jié)劑及動物模型觀察巨核細(xì)胞和血小板的變化。
　　目的:
　　探究自噬紊亂對巨核細(xì)胞發(fā)育可能造成的影響，影響的具體階段以及發(fā)生機制。
　　方法:
　　我們主要通過利用體外自噬流調(diào)節(jié)藥物雷帕霉素（Rap），巴弗洛霉素（BafA）和體內(nèi)巨核細(xì)胞-血小板上自噬基因 Atg7特異性敲除小鼠模型（Atg7flox/flox PF4-Cre）分別造成不同發(fā)育階段的巨核細(xì)胞的自噬紊亂和自噬缺失研究自噬對巨核細(xì)

3、胞發(fā)育的影響。
　　1.體外研究：首先分別在造血干細(xì)胞和成熟的巨核細(xì)胞階段加入雷帕霉素（Rap），巴弗洛霉素（BafA）分別成功調(diào)節(jié)早期和晚期巨核細(xì)胞內(nèi)自噬的水平，主要通過western blot檢測經(jīng)典的自噬小體標(biāo)記物L(fēng)C3-II的蛋白表達(dá)予以確認(rèn)。然后，結(jié)合巨核細(xì)胞發(fā)育前、后期不同的特點依次檢測了發(fā)育前期巨核細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)成熟，代表分化程度的膜蛋白表達(dá)，前血小板的形成，血小板的釋放和發(fā)育后期巨核細(xì)胞產(chǎn)生前血小板的能力。<

4、br>　　2.體內(nèi)研究：檢測正常生理情況下Atg7flox/flox PF4-Cre小鼠與其同窩對照小鼠Atg7flox/flox的血小板數(shù)目，巨核細(xì)胞的成熟，以及在低劑量X射線輻照誘導(dǎo)條件下，小鼠獲得暫時性血小板減少癥之后的血小板恢復(fù)情況。
　　3.機制初步探討：主要運用western blot及Q—PCR的方法檢測調(diào)控巨核細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的分子表達(dá)，解釋自噬調(diào)控巨核細(xì)胞發(fā)育的可能機制。
　　結(jié)果:
　　我們在原代分離的

5、小鼠胎肝細(xì)胞培養(yǎng)基中加入雷帕霉素（Rap）誘導(dǎo)自噬或巴弗洛霉素（BafA）阻礙自噬，我們發(fā)現(xiàn)與溶劑對照組（DMSO）相比自噬被調(diào)節(jié)的兩組產(chǎn)生的多倍體巨核細(xì)胞數(shù)量明顯減少(Rap54.8±0.6％，BafA50.4±3.8%，Ctrl71.1±2.0%，P<0.05)，同時代表巨核系細(xì)胞分化的膜蛋白CD41和CD61表達(dá)(Rap1.0±0.1%，BafA0.7±0.0%，Ctrl5.2±0.1%，P<0.001)及血小板釋放(Rap0.4

6、±0.3%，BafA0.7±0.1%，Ctrl8.5±0.5%，P<0.05)均顯著性降低即用雷帕霉素（Rap）或巴弗洛霉素（BafA）處理胎肝細(xì)胞能抑制巨核細(xì)胞的細(xì)胞核的成熟及巨核細(xì)胞系的分化。與此同時，我們又檢測了不同處理組誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞內(nèi)調(diào)控整個造血系統(tǒng)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（CyclinD1，CyclinD2以及P21）的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)Rap和BafA處理組的胎肝誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞中GATA-1(Rap0.56

7、±0.14，P<0.05;BafA0.40±0.06，P<0.01)，CyclinD1(Rap0.44±0.03，P<0.001;BafA0.68±0.06，P<0.01)，CyclinD2(Rap0.25±0.03，P<0.001;BafA0.35±0.02，P<0.05)以及P21(Rap0.04±0.02，P<0.05;BafA0.04±0.02，P<0.05)表達(dá)均比對照組(GATA-1:Ctrl1.15±0.13;Cyclin

8、D1: Ctrl1.0±0.07; CyclinD2: Ctrl0.49±0.03; P21: Ctrl0.16±0.03)顯著性降低；接著我們又檢測了磷酸化的肌球蛋白輕鏈（P-MLC），發(fā)現(xiàn)Rap處理組磷酸化水平與對照組相比有顯著性的增高并且該組的巨核細(xì)胞的大小也降低，但是我們在BafA處理組中并未發(fā)現(xiàn)MLC磷酸化水平和細(xì)胞大小的改變即雷帕霉素或巴弗洛霉素能影響胎肝來源的巨核細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1，CyclinD2以及P2

9、1，轉(zhuǎn)錄因子GATA-1的表達(dá)及MLC的磷酸化水平。
　　然而，我們在巨核細(xì)胞純化之后再在其培養(yǎng)基中加入Rap或BafA調(diào)節(jié)自噬，發(fā)現(xiàn)前血小板生成未出現(xiàn)異常，這與我們在巨核細(xì)胞-血小板自噬基因Atg7特異性敲除小鼠Atg7flox/flox PF4-Cre中觀察得到的正常血小板計數(shù)和巨核細(xì)胞成熟的表型相符，同時自噬基因Atg7特異性敲除并不影響小鼠抵抗低劑量的X射線輻照的血小板恢復(fù)情況。
　　綜上所述，我們的實驗表明在早期造

10、血干細(xì)胞階段對自噬進(jìn)行干預(yù)調(diào)節(jié)能抑制巨核細(xì)胞發(fā)育及血小板的生成，提示我們該階段可能是治療血小板減少的相關(guān)疾病潛在的靶點。
　　結(jié)論:
　　在造血干細(xì)胞階段上調(diào)或者下調(diào)自噬能抑制巨核細(xì)胞發(fā)育的整個過程，巨核細(xì)胞的成熟受抑制會進(jìn)一步影響血小板的最終生成，自噬對巨核細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控主要通過對轉(zhuǎn)錄因子GATA-1，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CyclinD2、P21以及RhoA下游分子P-MLC的調(diào)節(jié)實現(xiàn)的。
　　在成熟的