細(xì)胞自噬對內(nèi)皮祖細(xì)胞功能影響的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　目前研究認(rèn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能異常是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，受損內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)對于動脈粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，是受損內(nèi)皮修復(fù)的主要參與者。EPCs主要存儲于骨髓、脾臟等器官，在生理或病理因素刺激下，EPCs從骨髓、脾臟等動員，遷移到外周血并歸巢至損傷血管附近，參與受損內(nèi)皮的修復(fù)。然而，傳統(tǒng)方

2、式以EPCs移植為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療，由于受循環(huán)中多種心血管危險因素的影響，移植后的EPCs生物學(xué)功能受到損害，增殖能力降低，生存能力減弱，局限了細(xì)胞治療向臨床的轉(zhuǎn)化。因此，尋求提高應(yīng)激條件下EPCs的生存能力，促進(jìn)EPCs增殖，改善受損內(nèi)皮的修復(fù)，對有效防治動脈粥樣硬化性心血管疾病具有重要意義。
　　自噬(autophagy)是真核細(xì)胞特有的降解長壽命蛋白和受損細(xì)胞器的主要途徑，也是細(xì)胞適應(yīng)不利環(huán)境，維持穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)生存的重要方式。細(xì)

3、胞自噬受多種因素的影響，目前研究認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的失衡是影響自噬水平的重要因素;然而由于胞內(nèi)外鈣信號的復(fù)雜變化，鈣離子對細(xì)胞自噬調(diào)控的信號通路及自噬水平的變化趨勢尚存爭議。EPCs作為非興奮細(xì)胞，鈣庫操縱性鈣內(nèi)流（store operated calcium entry，SOCE）是其主要鈣內(nèi)流的方式，由鈣庫操縱性鈣通道(store operated calcium channels，SOCC)復(fù)合體介導(dǎo)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，EPCs

4、上不僅普遍表達(dá)SOCC復(fù)合體組成蛋白STIM1、TRPC1和ORAI1，并且與EPCs的眾多生物學(xué)功能密切相關(guān)。因此，這提示我們SOCC復(fù)合體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流可能參與了EPCs自噬水平的調(diào)控，而通過對EPCs自噬水平的調(diào)節(jié)將有助于增強(qiáng)EPCs在應(yīng)激條件下的生存能力，提高移植后循環(huán)中EPCs的生存效率，進(jìn)一步改善受損內(nèi)皮的修復(fù)。
　　基于以上原因，本研究利用動脈粥樣硬化模型小鼠及體外模擬動脈粥樣硬化危險因素-氧化型低密度脂蛋白(oxid

5、ized low density lipoprotein，ox-LDL)，探討SOCE介導(dǎo)的細(xì)胞自噬在EPCs生物學(xué)功能中的作用及機(jī)制，尋求提高細(xì)胞自噬的臨床藥物，為提高EPCs移植效率提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　方法：
　　1.動脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖、遷移能力及和自噬水平的變化
　　2.ox-LDL對大鼠EPCs增殖、遷移能力，SOCE及細(xì)胞自噬水平的影響
　　3.SOCE-CAMKK2-MTOR介導(dǎo)的

6、細(xì)胞自噬與EPCs功能的關(guān)系
　　4.匹伐他汀通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬影響EPCs功能
　　結(jié)果：
　　1.動脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖、遷移能力及自噬水平的變化
　　1.1 動脈粥樣硬化模型小鼠建立及EPCs的培養(yǎng)、鑒定
　　成功構(gòu)建動脈粥樣硬化小鼠模型，在小鼠主動脈處可見明顯的脂質(zhì)斑塊的形成。成功分離、培養(yǎng)及鑒定EPCs，分離第1日細(xì)胞可見呈圓形的貼壁狀態(tài)，第三日可見細(xì)胞呈鋪路石樣改變，第五日可見細(xì)胞呈梭形

7、、紡錘形改變，并呈線樣排列。流式細(xì)胞儀分析后顯示大部分細(xì)胞為VEGFR2、CD133、CD34陽性細(xì)胞。熒光染色后顯示大部分細(xì)胞同時表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物(UEA)并具有結(jié)合LDL的能力。
　　1.2 動脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖和遷移功能的變化
　　利用CCK-8分析動脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖活性，可見高脂飲食12周后EPCs增殖能力顯著降低，高脂飲食16周后EPCs增殖能力進(jìn)一步降低。Transwell結(jié)果提

8、示高脂飲食12周后EPCs遷移能力降低，高脂飲食16周后進(jìn)一步降低。
　　1.3 動脈粥樣硬化模型小鼠EPCs的自噬水平的變化
　　分離培養(yǎng)動脈粥樣硬化模型小鼠EPCs7天后，檢測胞內(nèi)自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)，可見隨著動脈粥樣硬化進(jìn)展LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)比例降低，p62表達(dá)增加，激光共聚焦顯微鏡下自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量減少。
　　2.ox-LDL對EPCs增殖、遷移能力，SOCE及細(xì)胞自噬水平的影響
　　2.1 在觀

9、察到動脈粥樣硬化模型小鼠EPCs生物學(xué)功能和自噬水平的改變后，我們采用動脈粥樣硬化危險因素ox-LDL體外模擬動脈粥樣硬化形成微環(huán)境。通過CCK-8分析我們發(fā)現(xiàn)ox-LDL呈劑量和時間依賴性降低EPCs增殖能力。在遷移小室實驗中，ox-LDL同樣顯著降低EPCs遷移能力。
　　2.2 在檢測到ox-LDL對EPCs增殖、遷移能力的影響之后，我們檢測EPCs內(nèi)鈣濃度，發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理后，EPCs內(nèi)鈣濃度顯著增加，ox-LDL是否

10、通過SOCE引起胞內(nèi)鈣濃度變化的，我們進(jìn)一步在激光共聚焦下觀察到ox-LDL瞬時刺激EPCs后引起了胞內(nèi)鈣庫的釋放，5分鐘后再向無鈣的細(xì)胞外液中加入2 mM鈣離子，進(jìn)一步引起了胞內(nèi)鈣濃度的增加，胞內(nèi)鈣的再次增加是通過SOCE介導(dǎo)，并呈現(xiàn)劑量依賴性。我們根據(jù)公式計算得到細(xì)胞內(nèi)實際鈣離子濃度，我們證實ox-LDL激活SOCE引起EPCs內(nèi)鈣水平增加。此外，STIM1作為SOCC重要組成蛋白，STIM1是否參與ox-LDL誘導(dǎo)的SOCE，我們

11、檢測ox-LDL處理后STIM1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)60和100μg/ml ox-LDL暴露12小時后顯著增強(qiáng)STIM1表達(dá)。
　　2.3 根據(jù)以上結(jié)果我們確定60μg/ml為后續(xù)實驗組ox-LDL濃度，我們采用慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方式沉默SOCC復(fù)合體關(guān)鍵蛋白STIM1，隨后再用60μg/ml ox-LDL瞬時刺激EPCs，在共聚焦顯微鏡下可見在STIM1沉默組ox-LDL引起胞內(nèi)鈣庫釋放的鈣振幅顯著減弱，同時在細(xì)胞外液中補(bǔ)充2 mM濃度的鈣

12、離子后，STIM1沉默組的SOCE振幅依然顯著低于對照組。我們在補(bǔ)充外液鈣離子前30秒用SOCE特異性抑制劑50μM2-APB預(yù)處理細(xì)胞，結(jié)果顯示2-APB組能夠顯著抑制ox-LDL引起的SOCE，進(jìn)一步證實ox-LDL激活SOCE。
　　2.4 隨后我們檢測ox-LDL對EPCs自噬水平的影響，發(fā)現(xiàn)ox-LDL呈劑量-時間依賴性顯著增加EPCs內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例，結(jié)果顯示ox-LDL增強(qiáng)EPCs自噬水平。結(jié)合自噬體和溶酶體

13、特異性阻斷劑BAFA1和CQ，我們在激光共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)ox-LDL促進(jìn)EPCs自噬流。
　　3.SOCE-CAMKK2-MTOR介導(dǎo)的細(xì)胞自噬與EPCs功能的關(guān)系
　　3.1 細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA-AM)和細(xì)胞外鈣離子螯合劑(EGTA)預(yù)處理后顯著逆轉(zhuǎn)ox-LDL引起的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加(p＜0.01)，同時共聚焦顯微鏡下也顯示細(xì)胞內(nèi)外鈣離子螯合劑預(yù)處理后，減少了ox-LDL引起的自噬體和自噬溶酶體的增加(

14、p＜0.01)。
　　3.2 隨后我們探究ox-LDL是如何激活EPCs自噬的，發(fā)現(xiàn)60μg/ml ox-LDL處理EPCs12小時后，增加了CAMKK2(p＜0.01)和AMPK(p＜0.01)磷酸化水平，降低了MTOR(p＜0.01)和P70S6K(p＜0.01)的磷酸化水平。采用CAMKK2特異性抑制劑預(yù)處理后，在顯著降低ox-LDL引起的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(p＜0.01)比例的同時，逆轉(zhuǎn)了ox-LDL對AMPK(p＜0.0

15、1)磷酸化，增加了MTOR(p＜0.01)和P70S6K(p＜0.01)的磷酸化。此外，通過慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染沉默STIM1后，ox-LDL上調(diào)的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和CAMKK2磷酸化被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實，ox-LDL通過SOCE-CAMKK2-MTOR通路激活EPCs自噬。
　　3.3 為進(jìn)一步探究自噬與EPCs功能的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)沉默EPCs自噬后，RTCA和CCK-8結(jié)果顯示ox-LDL進(jìn)一步抑制EPCs增殖能力(p＜0.01)

16、;此外，采用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后再暴露于ox-LDL，EPCs增殖能力也進(jìn)一步抑制(p＜0.01)。該結(jié)果證實ox-LDL激活的自噬保護(hù)應(yīng)激環(huán)境下EPCs增殖能力。
　　4.匹伐他汀通過調(diào)節(jié)自噬影響EPCs功能
　　我們在尋求提高EPCs功能的藥物中發(fā)現(xiàn)，匹伐他汀(Pitavastatin，PTV)顯著提高EPCs增殖和遷移能力的同時上調(diào)了自噬關(guān)鍵蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例，降低了p62的表達(dá)，激活了EPCs自噬。當(dāng)

17、我們采用慢病毒沉默自噬后，PTV改善EPCs增殖和遷移能力被逆轉(zhuǎn);此外，自噬抑制劑3-MA預(yù)處理EPCs后，PTV改善EPCs增殖和遷移的能力同樣被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證明，PTV通過增強(qiáng)EPCs自噬的方式改善EPCs功能。
　　結(jié)論：
　　1.動脈粥樣硬化模型小鼠中EPCs增殖、遷移能力減弱，自噬水平降低;
　　2.體外ox-LDL模擬動脈粥樣硬化形成微環(huán)境，EPCs增殖、能力減弱，SOCE被激活，自噬水平增強(qiáng);