辛伐他汀對LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞功能的影響.pdf

1、背景：膿毒癥是是目前患病率和死亡率最高的疾病之一，歐美國家膿毒癥的患病率在10％以上，我國缺乏相應(yīng)資料，但根據(jù)抗生素使用情況判斷，其患病率遠在歐美國家之上，膿毒癥成為嚴(yán)重威脅著人類健康的最主要疾病之一；為降低膿毒癥的患病率和病死率，早在2002年就由多個國家學(xué)會共同提出了“surviving sepsiscampaign”，并根據(jù)大量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)和廣泛論證，提出了“sepsis resuscitationbundles”和“Sepsis

2、 management bundle”，從2008年起在世界各地進行推廣；經(jīng)過大量的努力，同時伴隨診療技術(shù)的不斷提高，2010年數(shù)據(jù)分析顯示膿毒癥的病死率仍在30.8％。如何降低其發(fā)病率和病死率是當(dāng)今研究的熱點和難點。研究證明，毛細血管內(nèi)皮細胞功能異常及結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞脫落變形、凝血功能異常、毛細血管滲漏等在膿毒癥的病情進展中其重要作用，成年內(nèi)皮細胞的自我增殖和修復(fù)能力有限，內(nèi)皮祖細胞是出生后血管內(nèi)皮損傷修復(fù)的重要細胞，研究表明循

3、環(huán)內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和功能直接影響到膿毒癥患者的預(yù)后。細菌脂多糖是革蘭氏陰性桿菌的主要致病原，實驗中經(jīng)常用LPS體內(nèi)注射模擬機體感染過程；3-羥-3-甲基戊二酸輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑(他汀類藥物)通過抑制HMG-CoA還原酶的活性，而抑制膽固醇的生成、降低血膽固醇的水平，最近研究表明，在有效地調(diào)節(jié)血脂水平外，還具有抑制平滑肌增生和血小板聚集以及抑制炎癥

4、反應(yīng)等作用，有研究證明他汀類藥物還能促進血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程，而且已經(jīng)證實EPCs在該過程中扮演了重要角色，研究證實他汀類藥物有動員內(nèi)皮祖細胞、提高內(nèi)皮功能等作用。自2000年Ando首先報道他汀類藥物可以改善大鼠膿毒癥的生存率后，多個大規(guī)模臨床觀察顯示，他汀類藥物能降低膿毒癥的患病率和病死率，但對于LPS對EPCs數(shù)量及功能的影響及他汀類藥物對LPS作用下的內(nèi)皮祖細胞作用未見相關(guān)報道。
　　 目的：⑴從臍靜脈血獲得人

5、EPCs，鑒定并進行體外傳代培養(yǎng)。⑵將脂多糖(LPS)與人臍血EPCs共孵育，在相應(yīng)時間點添加不同劑量辛伐他汀，觀察LPS對人臍血EPCs增殖、遷移、黏附、凋亡的影響及辛伐他汀干預(yù)作用；⑶將不同濃度辛伐他汀與人臍血EPCs共孵育，相應(yīng)時間點加入LPS，觀察辛伐他汀對EPCs增殖、遷移、黏附功能的影響，以及預(yù)先應(yīng)用辛伐他汀后LPS對人臍血EPCs增殖、遷移、黏附的影響；通過該研究明確在細胞水平單純LPS及辛伐他汀對內(nèi)皮細胞祖的影響，及兩者

6、的相互影響，為進一步進行作用機理探討提供基礎(chǔ)。
　　 方法：第一部分：采用密度梯度離心法從臍靜脈血獲取單個核細胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被培養(yǎng)板上，誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，收集貼壁細胞，通過細胞形態(tài)觀察及DiI-acLDL、FITC-UEA-I染色激光共聚焦顯微鏡培養(yǎng)細胞。第二部分：將等量臍靜脈血來源EPCs(UCBEPCs)接種到96孔培養(yǎng)板上，隨機分為對照組：UCBEPCs與EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)48小時；LPS組，UCBEPC

7、s與GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)48小時；LPS+simy0.1組：UCBEPCs與GN-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)24小時后，加入0.1μmol/L辛伐他汀培養(yǎng)至48小時；LPS+simv1.0組：UCBEPCs與GM-2MY標(biāo)準(zhǔn)液和LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)24小時后，加入1.0μmol/L辛伐他汀培養(yǎng)至48小時；LPS+simv10.0組：UCBEPCs與GM-2

8、MV標(biāo)準(zhǔn)液和LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)24小時后，加入10.0μ mol/L辛伐他汀培養(yǎng)至48小時。應(yīng)用MTT比色法測定EPCs增殖功能和粘附功能，通過Transwell小室觀察EPCs遷移功能。統(tǒng)計學(xué)處理：結(jié)果中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，資料采用SPSS(16.0版)統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較用隨機取組設(shè)計的方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。第三部分：將等量EPCs接種到96孔培養(yǎng)板上，隨機分為對照組：

9、UCBEPCs與EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)48小時；LPS組：UCBEPCs與GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)48小時；Sim0.1+LPS組：UCBEPCs與GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和0.1μmol/L辛伐他汀共同孵育24小時后，加入LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)至48小時；Sim1.0+LPS組：UCBEPCs與GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和1.0μ mol/L辛伐他汀共同孵育24小時后，加入LPS液(100 ng/

10、mL)共同培養(yǎng)至48小時；Sim10.0+LPS組：UCBEPCs與GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和10.0μmol/L辛伐他汀共同孵育24小時后，加入LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)至48小時；辛伐他汀組：UCBEPCs與GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和1.0μmol/L辛伐他汀共同孵育48小時。應(yīng)用MTT比色法測定EPCs增殖功能和粘附功能，通過Transwell小室觀察EPCs遷移功能，應(yīng)用流式細胞儀檢測EPCs凋亡情況，細胞凋亡率(AP)計算公式

11、：AP=凋亡細胞數(shù)/總檢測細胞數(shù)。統(tǒng)計學(xué)處理：結(jié)果中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，資料采用SPSS(16.0版)統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組問比較用隨機取組設(shè)計的方差分析，以P<0.05為差異有顯著性
　　 結(jié)果：第一部分：經(jīng)鑒定分離培養(yǎng)細胞為EPCs，經(jīng)復(fù)蘇傳代見細胞生長良好。第二部分：臍靜脈血來源EPCs與LPS共孵育后其增殖、遷移顯著降低(P=0.009、P=0.026)，黏附能力也下降，但差異無顯著性(P=0.279)

12、。臍靜脈EPCs與LPS共孵育后加入不同濃度辛伐他汀，EPCs的增殖、遷移和黏附能力不同程度改善，隨辛伐他汀濃度增加，該作用增強，辛伐他汀濃度為1.0μmol/L時EPCs增殖顯著改善(P=0.017)，濃度10.0μmol/L時EPCs增殖、黏附、遷移功能，較LPS組均顯著改善(P=0.00，P=0.002，P=0.00)，其中黏附和遷移功能較空白對照組顯著改善(P=0.039，P=0.000)。第三部分：人EPCs與LPS共孵育后其

13、凋亡率顯著增加(12.632±0.5271 vs3.0266±0.5271，P<0.00)。辛伐他汀(1.0umol/L)與EPCs共孵育，EPCs各檢測指標(biāo)與對照組比較均無顯著變化。UCBEPCs與不同濃度辛伐他汀孵育后再加入LPSEPCs的增殖、遷移和黏附能力較LPS組不同程度改善，凋亡率降低，隨辛伐他汀濃度增加，該作用增強，辛伐他汀濃度為0.1umol/L EPCs增殖、黏附、遷移功能較LPS組有改善，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.68

14、7、0.501、0.683)，EPCs凋亡率顯著降低(9.2750±0.5961 vs12.632±0.5271，P=0.00)，辛伐他汀濃度為10.0μ mol/L時，EPCs增殖、黏附、遷移功能，較LPS組均顯著改善(P=0.035，P=002，P=0.011)，其中粘附功能較對照組也有顯著改善(P=0.039)，不同濃度辛伐他汀與EPCs作用24小時后再與LPS共孵育，其EPCs凋亡率較LPS組均顯著改善，但仍高于對照組和辛伐他汀

15、組。
　　 結(jié)論：自臍靜脈血可成功分離內(nèi)皮祖細胞，并可在體外進行傳代培養(yǎng)。LPS與UCBEPCs共孵育，可使UCBEPCs增殖和遷移功能顯著降低，黏附能力下降，凋亡率顯著增加。單純應(yīng)用辛伐他汀(1.0umol/L)與UCBEPCs共孵育，對UCBEPCs的增殖、粘附、遷移功能及細胞凋亡無顯著影響。辛伐他汀可以改善LPS導(dǎo)致的EPCs增殖、黏附、遷移功能的降低，在研究范圍內(nèi)改善作用隨濃度增加而增強。提前應(yīng)用辛伐他汀與EPCs共孵育