內(nèi)皮祖細胞移植對睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能的影響及機制.pdf

1、目的:建立一種高效、穩(wěn)定的獲取大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitorcells,EPCs)的方法,探討EPCs的歸巢特征以及。EPCs移植對睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能的影響及其可能機制。
　　 方法:(1)采用密度梯度離心法獲取大鼠骨髓源性單個核細胞,置于EGM-2MV中進行培養(yǎng)、擴增,利用免疫細胞化學(xué)染色鑒定EPCs表面標(biāo)志CD31、CD34、Ⅷ因子,雙熒光染色觀察EPCs內(nèi)吞Dil-acLDL及結(jié)合

2、FITC-UEA-1的能力。(2)EPCs培養(yǎng)7d時,采用攜帶增強型綠色熒光蛋白的重組腺病毒(Ad-eGFP),按重復(fù)感染倍數(shù)(multiplication of infection,MOI)=50時轉(zhuǎn)染EPCs,72h后在熒光顯微鏡下觀察eGFP在EPCs中的表達并計算轉(zhuǎn)染效率。(3)建立睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型,并將動物分為三組,每組6只,假手術(shù)組:左側(cè)睪丸未扭轉(zhuǎn)；缺血再灌注損傷組(IRI組):睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后經(jīng)大鼠股靜脈注射1ml生理鹽水；

3、內(nèi)皮祖細胞(EPCs組):睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后經(jīng)大鼠股靜脈注射1ml細胞懸液(EPCs數(shù)為1.0×106個)。另外對3只睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后大鼠進行Ad-eGFP轉(zhuǎn)染后的EPCs移植。術(shù)后5d,采用活體熒光成像系統(tǒng)及組織冰凍切片技術(shù),觀察移植EPCs的歸巢特征,檢測各組睪丸組織病理變化、凋亡細胞／生精小管情況以及睪丸組織VEGF mRNA和蛋白表達水平。
　　 結(jié)果:(1)成功獲取大鼠骨髓源性EPCs。培養(yǎng)10d時,EPCs表面標(biāo)志CD31

4、、CD34、Ⅷ因子陽性率均超過80％,EPCs可內(nèi)吞Dil-acLDL、表面可附著FITC-UEA-1。(2)轉(zhuǎn)染72h后,Ad-eGFP對EPCs的轉(zhuǎn)染效率大于73.7％,在熒光顯微鏡下可見綠色熒光陽性的細胞。(3)術(shù)后5d,活體熒光成像系統(tǒng)顯示左側(cè)陰囊區(qū)域有較強的熒光信號,其他區(qū)域則未見熒光信號。通過熒光顯微鏡,可見左側(cè)睪丸組織中有分布不均的綠色熒光細胞,而在脾臟、肝臟、腎臟組織中則未發(fā)現(xiàn)。假手術(shù)組生精小管結(jié)構(gòu)及細胞正常,凋亡細胞／

5、生精小管為0.09±0.02。IRI組生精細胞稀少,凋亡細胞／生精小管為2.82±0.81。EPCs組生精上皮較IRI組顯著增厚,生精細胞增多,EPCs組凋亡細胞／生精小管為0.32±0.09,顯著低于IRI組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。假手術(shù)組與EPCs組比較,凋亡細胞／生精小管無明顯變化(P=0.42)。與假手術(shù)組比較,IRI組、EPCs組VEGFmRNA及蛋白表達均顯著升高(P<0.05)；與IRI組比較,EPCs組VEG