移植血管內(nèi)皮祖細(xì)胞對創(chuàng)傷后大鼠腦組織水腫及預(yù)后的影響.pdf

1、背景:
　　自從Asahara等人于1997年第一次從外周循環(huán)血液中分離提取出CD34，后來學(xué)者們發(fā)現(xiàn)其有向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的趨勢，并能向創(chuàng)傷組織遷移歸巢隨之將其命名為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，它屬于多能干細(xì)胞的一種，定植于骨髓之中，在創(chuàng)傷后向靶區(qū)域遷移并分化成為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，其表達(dá)CD34+/CD133+，這一發(fā)現(xiàn)使人們對血管新生有了一個嶄新的認(rèn)識，并從血管新生的源頭來思考促進(jìn)血管再生以及治療缺血性疾病的方法。
　　近年來，E

2、PCs的生理學(xué)特性及臨床應(yīng)用價(jià)值越來越多地成為研究的熱點(diǎn)，Warner等發(fā)現(xiàn)在急性心肌梗死的患者中外周血EPCs含量明顯增加，并且其數(shù)量越高，發(fā)生心血管事件的概率及病死率就越低，EPCs已成功的在一些缺血性疾病，如肢體缺血性疾病、心血管疾病、原發(fā)性肺動脈高壓等疾病中得到應(yīng)用。其促進(jìn)血管新生主要有兩個方面的機(jī)制:一是可以直接分化為新生血管，二是可分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)來促進(jìn)這一過程，移植外源性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞或者使用一些促血管生成

3、的藥物來提高外周血中EPCs的含量，可明顯改善缺血性疾病，尤其是外周血管性疾病以及心血管疾病中患者的預(yù)后。但在腦組織缺血，特別是創(chuàng)傷后腦組織缺血中的研究和應(yīng)用卻很少。國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道了大量關(guān)于外傷后腦梗塞的預(yù)后分析與治療經(jīng)驗(yàn)，證明在創(chuàng)傷后的腦組織中存在缺血與局部循環(huán)障礙，使用促進(jìn)血管再生的藥物或可改善這一病理過程從而改善預(yù)后。
　　在腦創(chuàng)傷研究領(lǐng)域，研究方向多集中在神經(jīng)再生、腦保護(hù)及抑制腦水腫方面，其中血管源性腦水腫(VBE)被公認(rèn)

4、為是腦創(chuàng)傷及腦出血后最常見的一種腦水腫類型，也是引起腦疝導(dǎo)致死亡的主要原因，血管源性腦水腫的形成大多數(shù)情況下與血腦屏障遭到破壞，毛細(xì)血管通透性增加，血漿蛋白及水分滲出增加有關(guān)，而這一過程主要集中在局部微循環(huán)中，有學(xué)者擔(dān)心新生的毛細(xì)血管會增加血漿蛋白及水分的滲出從而加重腦水腫的形成，甚至有人嘗試使用抑制血管再生的藥物來緩解創(chuàng)傷后腦組織水腫，而療效較常規(guī)脫水、激素、抑肽酶等藥物尚未肯定。反而增加了外傷后腦梗塞形成的風(fēng)險(xiǎn)，以至于學(xué)界對腦創(chuàng)傷后

5、是否應(yīng)該使用促血管生成藥物未達(dá)成共識。
　　目的:
　　1.體外培養(yǎng)和鑒定大鼠外周血來源的EPCs。
　　2.通過鼠尾靜脈移移植EPCs到腦損傷大鼠，觀察對創(chuàng)傷區(qū)新生血管的影響。
　　3.測定大鼠腦含水量來估不同組別大鼠腦水腫程度。
　　4.神經(jīng)功能評分來判斷移植EPCs后血管新生、大鼠腦水腫程度以及預(yù)后的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.EPCs提取、體外培養(yǎng)及鑒定:開胸采集大鼠外周靜脈血，抗凝后

6、梯度離心分離單核細(xì)胞，接種于包被纖維連結(jié)蛋白的64孔板，37°貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)兩天，每3天換液一次，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，CD34+、CD133+、vWF等內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，采用熒光素標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白攝取試驗(yàn)和荊豆凝集素(FITC-UEA-1)結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞功能，流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞所占比率。
　　2.大鼠腦損傷模型制作:選用SD成年大鼠120只，分為手術(shù)組和假手術(shù)組，手術(shù)組又分為EPCs組，抑制血管生成組

7、和空白對照組，每組30只。三組均行中度顱腦損傷打擊，創(chuàng)傷后24小時(shí)內(nèi)，給予EPCs組鼠尾靜脈移植血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，抑制血管生成組給予局部及鼠尾靜脈注射VEGF抗體，空白對照組鼠尾靜脈注射等量細(xì)胞培養(yǎng)液，無菌飼料喂養(yǎng)。
　　3.神經(jīng)系統(tǒng)評分:每組大鼠每日按改良大鼠神經(jīng)功能評分(mNSS)評定大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷及恢復(fù)程度。
　　4.腦水腫程度評估:于第3日、第7日、第14日隨機(jī)數(shù)字法從三組大鼠中分別抽取10只，麻醉后升主動脈灌注生理

8、鹽水100ml，斷頭取腦，腦組織稱重，后放入50％蔗糖溶液脫水沉底，再次稱重，二者相減計(jì)算出腦組織含水量。
　　5.血管新生程度觀察:將脫水后的腦組織放入4％多聚甲醛中固定過夜，于創(chuàng)傷區(qū)做連續(xù)石蠟切片，免疫組化CD34+，CD133+染色，鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，觀察創(chuàng)傷區(qū)內(nèi)皮血管祖細(xì)胞聚集以及血管新生情況。
　　6.數(shù)據(jù)分析:將mNSS評分所得分?jǐn)?shù)、腦組織水腫數(shù)據(jù)，鏡下陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)輸入統(tǒng)計(jì)分析軟件，判斷其相關(guān)性及是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義。
　　結(jié)果:
　　在腦組織含水量的測定中，EPCs組腦組織平均含水量為(77.26±2.24)％，血管抑制組的腦組織平均含水量為(76.71±1.85)％，空白對照組的腦組織平均含水量為(75.48±1.92)％，三組數(shù)據(jù)差異運(yùn)用單因素方差分析，LSD檢驗(yàn)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（取P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。在神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷評分中，EPCs組得分明顯高于其他兩組，而血管抑制組和空白對照組得分差異并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在C