辛伐他汀對(duì)大鼠腦創(chuàng)傷后內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員和損傷腦組織血管再生影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1．研究大鼠骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定。 2．觀察辛伐他汀對(duì)腦創(chuàng)傷后大鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員和骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響。 3．探討辛伐他汀對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦創(chuàng)傷后血管再生的和空間學(xué)習(xí)能力的影響。 方法： 1．應(yīng)用密度梯度離心法分離大鼠骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用EGM-2培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)4天換液去除未貼壁細(xì)胞，以后每3天換液一次，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)

2、胞繼續(xù)培養(yǎng)至14天。培養(yǎng)7天后，應(yīng)用免疫熒光和流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 2．雄性Wistar大鼠24只，隨機(jī)分為生理鹽水組和辛伐他汀治療組，每組12只，大鼠制作液壓腦創(chuàng)傷模型成功后，傷后1天辛伐他汀治療組應(yīng)用20mg/kg/day辛伐他汀灌胃，鹽水組應(yīng)用等量鹽水灌胃，直至傷后2周。分別于傷前、傷后3、7和14d，取外周血測(cè)CD34+/CD133+內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)。體外實(shí)驗(yàn)方面，大鼠制作液壓腦創(chuàng)傷模型24h后，采用密度梯度離心法從大鼠

3、骨髓獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7天后，免疫熒光檢測(cè)DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙陽(yáng)細(xì)胞為正在分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞。以不同濃度辛伐他汀作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞，分別采用MTT比色法、Transwell小室和粘附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移和粘附能力。 3．70只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，鹽水組和辛伐他汀組。假手術(shù)組10只，鹽水組和辛伐他汀組分別為30只，制作腦創(chuàng)傷模型24小時(shí)后，辛伐他汀治療組應(yīng)

4、用20mg/kg/day辛伐他汀灌胃，鹽水組應(yīng)用等量鹽水灌胃。創(chuàng)傷后4、7天14天鹽水組和辛伐他汀組分別隨機(jī)取5只大鼠，取腦行冰凍切片免疫熒光檢測(cè)CD34和免疫組化檢測(cè)CD31。創(chuàng)傷后21到25天，假手術(shù)組，鹽水組和辛伐他汀組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)空間學(xué)習(xí)能力，并于水迷宮檢測(cè)完畢后取腦行冰凍切片免疫熒光檢測(cè)CD34陽(yáng)性細(xì)胞，并應(yīng)用免疫組化檢測(cè)CD31陽(yáng)性細(xì)胞作為微血管密度（MVD）。 結(jié)果： 1．培養(yǎng)4天換液去除

5、未貼壁細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)多為短梭型或多角形；培養(yǎng)7天，梭型細(xì)胞較前增多，形成細(xì)胞團(tuán)；培養(yǎng)9天，可見集落形成；10天可見到細(xì)胞形成索狀或網(wǎng)狀血管樣結(jié)構(gòu)；14天時(shí)，細(xì)胞呈鵝卵石樣外觀。DiI-acLDL和FITC-UEA-1免疫熒光染色雙陽(yáng)細(xì)胞為正在分化的EPCs，培養(yǎng)細(xì)胞7天時(shí)雙染陽(yáng)性比例>90%，10天時(shí)雙染陽(yáng)性比例>80%。流式細(xì)胞儀鑒定培養(yǎng)7天時(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞表型CD34和CD133雙陽(yáng)性的細(xì)胞為34．27±3．20%。 2．

6、辛伐他汀顯著增加大鼠腦創(chuàng)傷后血循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，體外實(shí)驗(yàn)顯示辛伐他汀顯著改善大鼠骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移和粘附能力。 3．與假手術(shù)組相比較，腦創(chuàng)傷后鹽水組創(chuàng)傷區(qū)周圍及傷側(cè)海馬齒狀回（DG）各時(shí)間點(diǎn)CD34+和MVD均高于假手術(shù)組；傷后創(chuàng)傷區(qū)周圍及傷側(cè)海馬DG各時(shí)間點(diǎn)CD34+數(shù)和MVD于傷后7天達(dá)到峰值，隨后有所下降；應(yīng)用辛伐他汀后，傷后14天和25天創(chuàng)傷區(qū)周圍及傷側(cè)海馬DG區(qū)CD34+數(shù)和MVD明顯高于與鹽水組（P

7、<0．05）。水迷宮檢測(cè)發(fā)現(xiàn)損傷大鼠存在明顯的空間學(xué)習(xí)能力的障礙，但辛伐他汀組傷后24和25天逃避潛伏期明顯比鹽水組大鼠縮短（P<0．05）。 結(jié)論： 1．大鼠骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞在體外應(yīng)用EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞，為內(nèi)皮祖細(xì)胞研究奠定了基礎(chǔ)。 2．辛伐他汀可以增加腦創(chuàng)傷后大鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員，并增強(qiáng)大鼠骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移和粘附能力。 3．辛伐他汀可以通過(guò)動(dòng)員和促進(jìn)內(nèi)皮