血管內(nèi)皮祖細胞移植應用于兔尿道缺損修復的實驗研究.pdf

1、研究背景： 先天畸形、外傷或腫瘤等疾病致使尿道損傷、狹窄或缺損，都需要進行尿道的修復、重建。盡管目前有300多種尿道修復的術式可供選擇，但是術后尿瘺、尿道狹窄等并發(fā)癥的發(fā)生率卻依然居高不下。臨床觀察證實，這些并發(fā)癥的出現(xiàn)幾率與術后尿道的血供豐富與否成反比。目前大量的動物實驗研究和臨床資料均表明，血管內(nèi)皮祖細胞(EPC)能幫助改善機體缺血部位和損傷部位的血供。 血管內(nèi)皮祖細胞(EPC)是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，又稱為成血管

2、細胞或者血管母細胞(angioblast)，是干細胞分化成熟過程中的一個細胞階段。研究表明，在臍帶靜脈血、成體外周血和骨髓中的CD34<'+>單個核細胞或CD133<'+>單個核細胞離體培養(yǎng)均能分化為內(nèi)皮樣細胞，從而認定這些細胞即為原始的血管內(nèi)皮祖細胞(EPC)，進一步的研究發(fā)現(xiàn)人臍帶血、外周血中的血管內(nèi)皮祖細胞(EPC)均來自于骨髓。機體的損傷或缺血可以通過引起內(nèi)源性VEGF的水平升高來動員骨髓中的血管內(nèi)皮祖細胞(EPC)向靶組織歸巢

3、、分化，而且在向成熟血管內(nèi)皮細胞(endothelial cell，EC)分化、參與靶組織的血管再生過程中對CD133的表達逐漸轉(zhuǎn)弱甚至消失。 國內(nèi)外尚未見到有關血管內(nèi)皮祖細胞(EPC)移植應用于尿道缺損修復方面的文獻報道。 研究目的： 觀察血管內(nèi)皮祖細胞(EPC)在尿道缺損修復術后改善新尿道組織血液循環(huán)的效果。為減少和避免臨床上尿道缺損修復術后尿瘺等并發(fā)癥的出現(xiàn)以及提高一期尿道修復的成功率提供一個新的思路。研究

4、方法： 無菌取兔雙下肢骨髓，應用密度梯度離心法分離并在體外培養(yǎng)其中單個核細胞層細胞，誘導其向血管內(nèi)皮祖細胞(EPC)方向分化，將細胞傳至第3代后備用。 人為去除雄性兔尿道中段長約1cm，制作成兔尿道缺損模型。然后應用制備好的人脫細胞羊膜基質(zhì)修復尿道缺損。同時，在實驗組中，將誘導培養(yǎng)后的第3代細胞點狀注射于修復后的尿道吻合口處及其外層的皮下組織中，對照組中應用等量的空白細胞培養(yǎng)液處理，術后按尿道下裂手術后常規(guī)護理。然后分別

5、于術后4 w、12 w切取修復后的尿道組織，10％福爾馬林固定，石蠟包埋切片后行HE染色，觀察新尿道組織中血管再生情況，并隨機計數(shù)100倍光鏡下20個視野內(nèi)毛細血管斷面的數(shù)目，應用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，比較實驗組與對照細間的差異有無統(tǒng)計學意義。 研究結果： 1、兔骨髓源單個核細胞在體外呈貼壁生長，48 h內(nèi)即貼壁牢靠。前4 d內(nèi)生長較慢，近乎靜止狀態(tài)，4 d后生長明顯加速，呈現(xiàn)出克隆樣生長；10 d后細

6、胞基本長滿瓶底，表現(xiàn)出典型的鋪路石樣改變；經(jīng)VEGF和bFGF在體外聯(lián)合誘導培養(yǎng)后，細胞表現(xiàn)出條索狀和草束狀的排列方式。細胞免疫化學染色顯示，目標細胞對CD133的表達水平下調(diào)，由具有CD34<'+>/CDl33<'+>/CD31<'+>表型的細胞群逐漸分化成具有CD34<'+>/CD133<'->/CD31<'+>表面特征的細胞群； 2、術后4 w、12 w分別行尿道組織學觀察，發(fā)現(xiàn)實驗組中毛細血管數(shù)目明顯多于對照組。4 w時