脫細(xì)胞材料應(yīng)用于眼部修復(fù)的實驗研究.pdf

1、隨著經(jīng)濟的進步，我國城鄉(xiāng)工業(yè)不斷發(fā)展，但是對勞動者的有效防護措施并沒有得到順利實施，因此在眼部整形手術(shù)中，繼發(fā)于機械性、化學(xué)性、熱損傷的眼瞼缺損、眶周組織缺損等情況日益增多。它們不僅會引起眼閉合不全和眼表組織的暴露，還會因持續(xù)而難以矯正的干眼導(dǎo)致角膜上皮壞死、基質(zhì)融解，進而引發(fā)角膜潰瘍穿孔，甚至失明，使得大量勞動者因此而喪失勞動能力。同時，上述情況還嚴(yán)重影響了患者的外觀，這在生活質(zhì)量日益重要的今天，對于患者的心理乃至社會交往都形成了明顯

2、的阻礙。 少于三分之一長度的眼瞼全層缺損可以通過直接縫合來修補，較大的缺損直接縫合相對困難，傳統(tǒng)的手術(shù)方式多是利用正常眼瞼組織或鄰近組織進行修補，但是這些方法對組織損傷大，手術(shù)過程復(fù)雜。因此近年來采用眼瞼缺損原位重建術(shù)(Eyelidreconstructioninprimaryposition)，用皮膚、瞼板替代物和結(jié)膜替代物對眼瞼的不同層次分別修復(fù)，既不破壞周圍健康組織，又可以恢復(fù)較為滿意的解剖結(jié)構(gòu)和外觀。在眼瞼原位重建術(shù)中，

3、瞼板的重建是手術(shù)的關(guān)鍵，因為眼瞼的外形和功能的完整性依賴于瞼板的支撐，如果沒有合適的瞼板，眼瞼修復(fù)后會因缺少具有一定硬度的支撐物而出現(xiàn)瞼內(nèi)翻、瞼退縮，從而導(dǎo)致手術(shù)失敗。理想的瞼板替代物一方面應(yīng)該與瞼板有相似的厚度、硬度、彈性及光滑的基底面，另一方面應(yīng)該具備易獲取，術(shù)中操作簡單，術(shù)后炎癥反應(yīng)輕等特性。 脫細(xì)胞組織基質(zhì)(AcellularTissueMatrix，ACTM)是近年來生物衍生材料方面的研究熱點。自從Meezan于197

4、5年用化學(xué)除垢劑制作了一些組織的無細(xì)胞基底膜以來，現(xiàn)在脫細(xì)胞組織基質(zhì)的制備多是以此基礎(chǔ)發(fā)展而來：即用化學(xué)除垢劑聯(lián)合其他輔助試劑脫去組織中的所有細(xì)胞、抗原、脂質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)等物質(zhì)，保留具有完整外觀形態(tài)和組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的不溶性基質(zhì)成分，主要包括膠原、彈性蛋白、蛋白多糖、糖胺多糖和非膠原糖蛋白。因此，脫細(xì)胞組織基質(zhì)不僅可以維持組織的正常構(gòu)型，還可以為細(xì)胞再生提供支架，同時因為除去了引起免疫反應(yīng)的細(xì)胞成分，因而避免了排斥反應(yīng)的發(fā)生。目前，以

5、脫細(xì)胞真皮為主的脫細(xì)胞組織基質(zhì)已在眼科領(lǐng)域內(nèi)得到廣泛應(yīng)用并收到良好效果。 硬腦膜和鞏膜同真皮的構(gòu)成類似，主要成分均是交織排列的膠原纖維，其中夾雜少量成纖維細(xì)胞、血管、內(nèi)皮細(xì)胞等，是眼部整形常用的異體修復(fù)材料，國外的一些廠商曾將異體組織進行商品化生產(chǎn)，價格昂貴。但由于異體組織的抗原性強、容易傳播疾病，故其應(yīng)用受到限制。因此，本研究探索將硬腦膜和鞏膜制備成脫細(xì)胞組織基質(zhì)的方法，從形態(tài)學(xué)上觀察其對瞼板組織的重塑效果，從免疫學(xué)改變方面分

6、析植入兔上瞼后硬腦膜和鞏膜抗原性的變化，為眼部修復(fù)手術(shù)尋找新的組織工程學(xué)材料。目前國內(nèi)外尚未見使用脫細(xì)胞處理的硬腦膜、鞏膜進行眼部修復(fù)的相關(guān)報道。 第一部分脫細(xì)胞組織的制備與鑒定 目的:以不同方法制備脫細(xì)胞硬腦膜和鞏膜，比較不同方法、濃度、作用時間對硬腦膜和鞏膜脫細(xì)胞效果的差異，找到適合硬腦膜和鞏膜的脫細(xì)胞方法。 方法:將取自8只新西蘭大白兔的硬腦膜和鞏膜組織剪成小塊，每種組織塊均分為8組，每組含有硬腦膜和鞏膜兩

7、種組織，4組用以0.5％、1％、2％、5％的TritonX-100為主，輔以DNase、RNase的方法處理，另外4組用0.25％胰蛋白酶和0.1％SDS分別處理12h+12h，12h+24h，24h+12h，24h+24h。完成后分別從大體觀察8組的外觀，HE染色比較脫細(xì)胞后的細(xì)胞殘留數(shù)，透射電鏡觀察膠原纖維的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果:以TritonX-100處理后的組織外觀與處理前相似，0.25％胰蛋白酶處理后的組織腫脹增厚。2％、

8、5％TritonX-100兩組和0.25％胰蛋白酶+0.1％SDS處理時間≥36h的三組組織內(nèi)的細(xì)胞殘留平均數(shù)都小于2個/高倍鏡視野。電鏡結(jié)果證實，硬腦膜和鞏膜經(jīng)過脫細(xì)胞處理后，膠原纖維結(jié)構(gòu)同處理前相同，未受到破壞。 結(jié)論:以TritonX-100處理的硬腦膜和鞏膜結(jié)構(gòu)緊湊，膠原纖維保存完好，其中，2％TritonX-100濃度處理過的組織殘留細(xì)胞少，處理前后外觀改變少，是適合硬腦膜和鞏膜進行脫細(xì)胞處理的方法。 第二部分

9、脫細(xì)胞硬腦膜行眼瞼修復(fù)的形態(tài)學(xué)及抗原性研究 目的:研究脫細(xì)胞硬腦膜植入新西蘭大白兔上瞼后的組織相容性，比較硬腦膜經(jīng)脫細(xì)胞處理前后抗原性的變化。 方法:用2％TritonX-100輔以DNase、RNase制備兔脫細(xì)胞硬腦膜。將20只新西蘭大白兔隨機平均分為兩組，每組10只，去除右上瞼10mm×3mm的瞼板后，分別植入兔交聯(lián)型異體脫細(xì)胞硬腦膜和異體硬腦膜。于植入后1周、4周、8周取兔外周血，行IgG、IgA、IgM、C3、

10、C4的定量測定；并用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞。于術(shù)后1周、4周、8周、12周取出植片，行免疫組織化學(xué)和HE染色檢查。 結(jié)果:脫細(xì)胞硬腦膜植入上瞼第1周，兩組動物外周血中IgG分別是異體硬腦膜：0.095g/l，脫細(xì)胞硬腦膜：0.07g/l，p＜0.05，兩組間有顯著性差異；IgA、IgM、C3和C4的改變無明顯差異。術(shù)后4周、8周，兩組間IgG、IgA、IgM、C3、C4和CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞定量均

11、無明顯差異，p＞0.05。術(shù)后1周、4周、8周、12周，植入局部的光鏡顯示：脫細(xì)胞硬腦膜組的炎癥反應(yīng)和淋巴細(xì)胞浸潤要小于異體硬腦膜組，成纖維細(xì)胞和新生血管長入情況相似，宿主成纖維細(xì)胞于術(shù)后8周基本完全長入植片。術(shù)后1、4、8周，CD4+T細(xì)胞計數(shù)顯示：脫細(xì)胞硬腦膜組明顯少于異體硬腦膜組，分別為5±2個、9±4個、11±3個；異體硬腦膜組分別為10±3個、31±4個、24±4個。CD8+T細(xì)胞計數(shù)：脫細(xì)胞組分別為：4±2個、8±2個、10

12、±3個；異體硬腦膜組分別為10±3個、23±5個、22±5個。 結(jié)論:脫細(xì)胞硬腦膜植入眼部后顯示出良好的組織相容性，可以有效地引導(dǎo)受體成纖維細(xì)胞和血管的長入，引起的炎癥反應(yīng)及淋巴細(xì)胞浸潤較異體硬腦膜小，可以成為外眼組織修復(fù)手術(shù)中有應(yīng)用價值的新型生物材料。 第三部分脫細(xì)胞鞏膜行眼瞼修復(fù)的形態(tài)學(xué)及抗原性研究 目的:研究脫細(xì)胞鞏膜植入新西蘭大白兔上瞼后的組織相容性，比較鞏膜經(jīng)脫細(xì)胞處理前后抗原性的變化。 方法:

13、用2％TritonX-100輔以DNase、RNase制備兔脫細(xì)胞鞏膜。將20只新西蘭大白兔隨機平均分為兩組，每組10只，去除右上瞼10mm×3mm的瞼板后，分別植入兔交聯(lián)型異體脫細(xì)胞鞏膜和異體鞏膜。于植入后1周、4周、8周取兔外周血，行IgG、IgA、IgM、C3、C4的定量測定；并于術(shù)后4周、8周用流式細(xì)胞儀檢測外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞。于術(shù)后1周、4周、8周、12周取出植片，行免疫組織化學(xué)和HE染色檢查。 結(jié)果

14、:脫細(xì)胞鞏膜和異體鞏膜植入上瞼后第1周、4周、8周，兩組間外周血IgG、IgA、IgM、C3、C4和CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞定量均無明顯差異，p＞0.05。術(shù)后1周、4周、8周，植入局部的光鏡顯示：脫細(xì)胞鞏膜組的炎癥反應(yīng)和淋巴細(xì)胞浸潤要小于異體鞏膜組，8周后植入的異體鞏膜組織中央部發(fā)生少量壞死溶解現(xiàn)象，兩組成纖維細(xì)胞和新生血管長入情況相似，于術(shù)后12周基本完全長入植片。術(shù)后1、4、8周，CD4+T細(xì)胞計數(shù)顯示：脫細(xì)胞鞏膜組明顯少于