高糖誘導氧化應激對大鼠內(nèi)皮祖細胞VEGFR表達的影響.pdf

1、目的:糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴重威脅人類健康的慢性疾病。DM合并血管病變是DM的主要并發(fā)癥之一,也是患者致死、致殘的主要因為。目前的研究認為DM大血管病變后側(cè)枝形成能力受損是引起DM患者血管病變最重要原因的之一。關于DM合并血管病變的發(fā)病機制一直是研究的熱點,既往提出四種機制,即多元醇通路的激活、晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advancedglycation end product

2、s,AGEs)的形成、PKC途徑及氨基已糖途徑的激活,這些均不能夠完全解釋DM血管并發(fā)癥的發(fā)病機制。最近的研究表明,氧化應激參與了心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過程,Banting獎獲得者Brownlee M提出“糖尿病并發(fā)癥的共同機制”學說,指出線粒體電子傳遞鏈過氧化物產(chǎn)生過量是高血糖導致血管損傷的共同機制。該學說合理解釋了氧化應激與糖尿病血管損傷的內(nèi)在聯(lián)系,被認為是糖尿病并發(fā)癥研究領域的一個突破性進展,獲得了廣泛關注。氧化應激增強所致的血管病

3、變與DM患者血管病變臨床后果及其病理改變相似,都涉及到內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖能力和新生血管的形成能力受損。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管新生最重要的因子之一,有人研究認為VEGF分泌減少導致了血管新生功能障礙,但在DM大鼠后肢缺血模型中發(fā)現(xiàn)VEGF的分泌并未減少,研究還發(fā)現(xiàn)VEGF治療DM合并的缺血性疾

4、病效果更差。提示DM患者肢體缺血后血管快速血運重建受阻與VEGF無關。目前,高糖對EPCs自身氧化應激水平的影響以及這種影響對EPCs表面血管內(nèi)皮細胞生長因子受體(vascular endothelial growth factor ReceptorVEGFR)表達產(chǎn)生的影響國內(nèi)外還尚無相關研究。我們利用大鼠淋巴細胞分離液分離大鼠骨髓沖洗液中的單個核細胞,培養(yǎng)3天后用Dil-標記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-labeled acetyl

5、ated LDL,DiI-acLDL)和FITC標記荊豆凝集素-1(fluorescein isothiocyanate-labeled Ulex europaeusagglutinin-1,FITC-UEA-1)雙染法進行的鑒定,顯示雙熒光陽性的細胞被認為是內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)。完成鑒定后的大鼠EPCs給予不同濃度(培養(yǎng)液終末葡萄糖濃度分別15mmol／L、30 mmol／L

6、、60 mmol／L)的高糖干預,分別在24h、48h、96h進行EPCs增殖能力檢測和自身氧化應激標志物的檢測,評估高糖對EPCs增殖和自身氧化應激水平的影響。最后,觀察高糖對大鼠EPCs表面VEGFR表達的影響,并通過抗氧化劑干預治療研究,初步探討高糖誘導的氧化應激對EPCs表面VEGFR表達的影響,為糖尿病患者肢體缺血后快速血運重建受阻提供理論支持。
　　 方法:將12只SD大鼠脫頸處死,用75％酒精浸泡消毒15 min。

7、置于超凈臺中,在無菌條件下分離其股骨和脛骨,剪去長骨兩端,暴露骨髓腔,用5ml注射器抽取含有1％肝素的PBS液沖洗骨髓腔,直至骨髓腔發(fā)白。利用大鼠淋巴細胞分離液分離大鼠骨髓沖洗液中的單個核細胞,培養(yǎng)3天后用DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙染法進行的鑒定,顯示雙熒光陽性的細胞被認為是內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor eells,EPCs)。5天后進行細胞傳代和試驗分組,根據(jù)培養(yǎng)液中終末葡萄糖濃度的不同分成

8、兩組:正常對照組(培養(yǎng)液終末葡萄糖濃度為5.5 mmol／L)和高糖干預組。高糖干預組又分為三個亞組:高糖1組(培養(yǎng)液終末葡萄糖濃度為15 mmol／L葡萄糖)；高糖2組(培養(yǎng)液終末葡萄糖濃度為30 mmol／L)；高糖3組(培養(yǎng)液終末葡萄糖濃度為60 mmol／L)。分別在24h、48h、96h用MTT法進行EPCs增殖檢測和檢測試劑盒進行氧化應激標志物抗O2-、丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glut

9、athione,GSH)檢測,最后在有和無抗氧化劑的治療干預下用免疫組化進行EPCsVEGFR表達檢測。
　　 結(jié)果:1.光鏡下大鼠EPCs的形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),剛分離的單個核細胞呈圓形,體型較小,在培養(yǎng)2天后出現(xiàn)貼壁,3d后有明顯集落形成,可見梭形細胞和細胞簇出現(xiàn),其結(jié)構(gòu)與血島相似,梭形細胞既有單個細胞也有線帶樣結(jié)構(gòu)。7d后梭形細胞線樣排列,隨培養(yǎng)時間增加,細胞形態(tài)逐漸變大,呈現(xiàn)出典型鋪路石樣改變。2.培養(yǎng)3d后的細胞呈現(xiàn)典型的Di

10、I-acLDL和FITC-UEA-1雙陽性染色,證實為EPCs。3.EPCs增殖能力檢測。高糖作用24h后與正常對照組(5.5 mmol／L)比較,高糖3組(60 mmol／L)的EPCs增殖能力顯著增強(P<0.05),高糖1組(15mmol／L)和高糖2組(30 mmol／L)無明顯差異；高糖作用48h后,高糖2組和高糖3組EPCs增殖能力顯著減弱(P<0.05)；作用96h后,高糖2組和高糖3組EPCs增殖能力進一步減弱(P<0.

11、05),正常對照組與高糖1組無明顯差異。各實驗組不同時間點與24h比較,正常對照組和高糖1組在48h和96h EPCs增殖能力分別顯著增強(P<0.05)；高糖2組EPCs增殖能力無明顯差異:高糖3組EPCs增殖能力在96h顯著減弱(P<0.05)。4.EPCs抗O2-濃度檢測。高糖作用24h后與正常對照組比較,高糖1組的EPCs抗O2-濃度明顯增加(P<0.05)；作用48h后與正常對照組比較,高糖干預組EPCs抗O2-濃度明顯減少(

12、P<0.05)；作用96h后與正常對照組比較高糖干預組EPCs抗O2-濃度進一步減少(P<0.05)。各實驗組不同時間點與24h相比,正常對照組在48h后抗O2-濃度明顯增加(P<0.05)；高糖1組無明顯差異；高糖2組和高糖3組在48h和96h抗O2-濃度均明顯減少(P<0.05)。5.EPCs MDA濃度檢測。高糖作用24h后與正常對照組比較,高糖干預組EPCs MDA濃度均無明顯差異；作用48h后,高糖2組和高糖3組EPCs MD

13、A濃度顯著增加(P<0.05)；作用96h后,高糖干預組EPCs MDA濃度均顯著增加(P<0.05)。各實驗組不同時間點與24h比較,正常對照組在48h和96hEPCs MDA濃度均無明顯變化；高糖1組在96h后EPCs MDA濃度顯著增加(P<0.05)；高糖2組和高糖3組在48h和96h后EPCs MDA濃度均顯著增加(P<0.05)。6.EPCs的GSH含量檢測。高糖作用24h后與正常對照組比較,高糖干預組EPCs的GSH含量無

14、明顯變化；作用48h和96h后高糖2組和高糖3組EPCs的GSH含量均顯著降低(P<0.05)；高糖1組無明顯變化。各實驗組不同時間點與24h相比,正常對照組在48h和96h后EPCs的GSH含量均顯著增加(P<0.05)；高糖1組EPCs的GSH含量無明顯差異；高糖2組和高糖3組在48h和96h后EPCs的GSH含量均顯著減弱(P<0.05)。7.EPCs VEGFR表達檢測。(1).高糖分別作用24h和48h后與正常對照組比較,高糖

15、2組和高糖3組EPCsVEGFR表達均顯著減少(P<0.05)；作用96h后,與正常對照組比較高糖干預組EPCs VEGFR表達均明顯減少(P<0.05)。各實驗組不同時間點與24h相比,正常對照組無明顯變化；高糖1組和高糖3組在96h后EPCs VEGFR表達明顯減少(P<0.05)；高糖2組EPCs VEGFR表達在48h和96h后均明顯減少(P<0.05)。(2).在有抗氧化劑存在條件下,各實驗組EPCs VEGFR表達隨時間,濃

16、度變化沒有明顯的差異。(3).與無抗氧化劑比較,抗氧化劑提高了高糖干預組EPCs VEGFR表達,在一定的程度上挽救了高糖干預組EPCs VEGFR表達的嚴重缺陷。
　　 結(jié)論:1.高糖明顯的抑制了大鼠EPCs增殖,且隨著葡萄糖濃度的增加和作用時間的延長抑制作用愈來愈強。2.高糖誘導大鼠EPCs自身氧化應激增強,抗氧化應激明顯減弱。且隨葡萄糖濃度的增加,時間的延長作用愈來愈強。3.高糖明顯抑制大鼠EPCs VEGFR的表達,但在