探討內(nèi)皮祖細胞大自噬和分子伴侶介導自噬相互作用的實驗研究.pdf

1、目的:體外誘導分化內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，然后應用大自噬激活劑雷帕霉素、大自噬抑制劑3-MA（3-甲基腺嘌呤）干預，探討干預后的EPCs中大自噬和分子伴侶介導的自噬生物學特性的變化，為下肢深靜脈血栓等疾病的治療提供一種新的思路和實驗依據(jù)。
　　方法:1.Ficoll密度梯度離心法獲取SD大鼠的骨髓單個核細胞(bone marrow-derived mononuclear c

2、ells，BMMNCs)，內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)基(EGM-2MV)體外誘導分化為EPCs并進行鑒定。觀察細胞形態(tài)學、增殖活性、內(nèi)皮細胞系列標志VEGFR-2、vwF免疫組化，祖細胞標志CD133、CD34免疫熒光技術動態(tài)鑒定。利用三維培養(yǎng)實驗鑒定EPC是否具有形成血管功能。
　　2.將貼壁EPCs細胞隨機分成2組，一組為雷帕霉素組，包括對照組（正常培養(yǎng)組）及雷帕霉素六個濃度組1μg/L、2.5μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg

3、/L、40μg/L的EGM-2MV培養(yǎng)基中。另一組為3-MA組，包括對照組及3-甲基腺嘌呤（3-methlyadenine 3-MA）六個濃度組，分別為1.25mmol/l、2.5mmol/l、5mmol/l、10mmol/l、20mmol/l、40mmol/l。各組分別培養(yǎng)24h。2.1、采用常規(guī)四氮唑藍(methylthiazol yltetrazolium MTT)比色法測定各濃度3-MA組、雷帕霉素組及對照組對EPCs增殖的作用

4、。2.2、利用Western blot檢測LC3-Ⅱ、LAMP2A蛋白表達的變化。2.3、利用免疫熒光方法分析LAMP2A蛋白熒光強度變化。
　　結(jié)果:1.新分離的骨髓單個核細胞(BMMNCs)呈圓形，大小不一，第3天左右大部分細胞開始貼壁，形態(tài)有梭形、三角形、紡錘形或不規(guī)則形，第5-8天左右出現(xiàn)細胞集落和細胞線狀排列，第8-12天接近融合，呈典型鵝卵石樣外觀。細胞生長曲線呈，“S”形，EPCs在培養(yǎng)的6～11天增殖較快，11天后

5、進入平臺期，生長曲線呈典型“s”形外觀。貼壁細胞的CD34、VEGFR、vWF、CD133均表達陽性。早期EPCs細胞增殖明顯，但未形成管腔樣結(jié)構(gòu)。晚期EPCs增殖明顯，形成網(wǎng)狀連接的管腔樣結(jié)構(gòu)。
　　2.經(jīng)雷帕霉素作用后測定的OD值呈明顯降低的趨勢，對照組明顯高于干預組(P＜0.05)。3-MA1.25mmol/l，2.5mmol/l對于EPCs作用24及48小時后細胞增殖和對照組相比無明顯影響，5mmol/l對于EPCs的增殖

6、有明顯的促進作用，10mmol/l，20mmol/l，40mmol/l3-MA和對照組相比明顯抑制EPCs增殖(P＜0.05)。
　　Western blot檢測各組目的蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素組LC3-Ⅱ蛋白在1-5ug/l范圍內(nèi)表達明顯升高的趨勢，干預組明顯高于對照組(P＜0.05)，在10-40ug/l范圍內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白隨著給藥濃度的增加呈逐漸遞減表達，其中10ug/l、20ug/l給藥組高于對照組(P＜0.05)，40

7、ug/l給藥組低于對照組(P＜0.05)。LMAP2A蛋白表達隨著給藥濃度的增加呈逐漸遞減表達，干預組蛋白表達明顯低于對照組(P＜0.05)。3MA組作用EPCs24小時后LAMP2A蛋白在1-10mmol/l范圍內(nèi)隨著給藥濃度的增加呈逐漸遞增表達，干預組蛋白表達明顯高于對照組(P＜0.01)，在20-40mmol/l范圍內(nèi)LAMP2A蛋白隨著給藥濃度的增加呈逐漸遞減表達，干預組蛋白表達高于對照組(P＜0.01)。LC3-Ⅱ蛋白表達隨著

8、給藥濃度的增加呈逐漸遞減表達，干預組蛋白表達明顯低于對照組(P＜0.05)。
　　免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)雷帕霉素組LAMP2A表達的平均光密度值跟對照組相比呈逐漸下降趨勢(P＜0.05)。3MA組LAMP2A表達的平均光密度值在1.25-10mmol/l范圍內(nèi)跟對照組相比呈逐漸上升趨勢，在10-40mmol/l范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，但跟對照組相比無顯著意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:說明內(nèi)皮祖細胞的大自噬和分子伴侶介導自噬之間