苯醌誘導(dǎo)HL60細(xì)胞自噬及活性氧在自噬發(fā)生中的作用.pdf

1、背景:
　　苯(Benzene)被普遍應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和日常生活，污染無處不在，暴露難于避免。長期慢性苯暴露可以引起進(jìn)行性骨髓退變、造成再生障礙性貧血，甚至是白血病。長期以來職業(yè)性苯中毒事件屢有發(fā)生，白血病的發(fā)病率也在不斷增加。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將苯確定為人類致癌物，苯導(dǎo)致的白血病也被我國確定為職業(yè)性腫瘤。2004年Lan等發(fā)表在Science上的文章指出，即使職業(yè)工人暴露于1 ppm苯濃度以下，也可導(dǎo)致明顯的白細(xì)胞和血小板降低、祖

2、細(xì)胞集落形成降低等血液毒性效應(yīng)，由此可見，苯的危害形勢嚴(yán)峻。因此，對苯實施深入研究具有重要的社會意義。苯經(jīng)過體內(nèi)代謝，可產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，包括超氧自由基（O2-）、過氧化氫自由基（HO2-）與過氧化氫(H2O2)等;可引起組織細(xì)胞氧化損傷，甚至是細(xì)胞凋亡，在苯介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和遺傳毒性中均起重要作用。
　　自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的重要途徑，通過自噬途徑可以清除、降解和消化生物體內(nèi)的異常蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器

3、以及一些壞死細(xì)胞，其降解產(chǎn)物為細(xì)胞的重建、再生和修復(fù)提供必要原料，實現(xiàn)細(xì)胞的再循環(huán)和再利用。自噬也是機(jī)體應(yīng)對環(huán)境壓力的重要調(diào)控機(jī)制，如在饑餓狀態(tài)下，肝細(xì)胞通過自噬作用，降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，進(jìn)行糖酵解，以維持生命活動重要的腦細(xì)胞和紅細(xì)胞等的能量供應(yīng)。然而過度自噬又可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自噬性凋亡，對機(jī)體產(chǎn)生損傷作用。許多研究表明在一些外源化學(xué)物所介導(dǎo)的機(jī)體損傷中涉及了自噬紊亂，然而迄今為止尚未見苯及其代謝物與細(xì)胞自噬相關(guān)的研究報道。本研究旨在探討

4、苯的活性代謝產(chǎn)物苯醌(Benzoquinone，BQ)能否誘導(dǎo)HL60細(xì)胞發(fā)生自噬以及活性氧(ROS)在自噬發(fā)生中的作用。
　　材料方法:
　　CCK8法檢測0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L BQ對HL60細(xì)胞的毒性作用，并據(jù)此選擇觀察細(xì)胞自噬效應(yīng)的適宜染毒濃度。將對數(shù)生長期細(xì)胞分為對照組、BQ染毒組（10μmol/L BQ染毒24h）、NAC組（抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸，5mmol/L NA

5、C處理24h）和BQ+NAC干預(yù)組（5mmol/L NAC干預(yù)1h后加10μmol/L BQ處理24h）。透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，吖啶橙染色檢測自噬酸性囊泡，免疫熒光染色法定性檢測自噬蛋白LC3的表達(dá)定位，蛋白免疫印跡法定量檢測LC3和Beclin1的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　CCK8檢測結(jié)果顯示，HL60細(xì)胞存活率隨BQ濃度增加而逐漸下降，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。BQ染毒終濃度在20.0、40.0μmol/L時細(xì)胞存活率與

6、對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），結(jié)合文獻(xiàn)報道，本文選取10μmol/L BQ濃度作為觀察誘導(dǎo)自噬效應(yīng)的受試劑量。自噬效應(yīng)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，吖啶橙染色顯示BQ染毒組橙紅色酸性囊泡明顯增多;通過透射電鏡也直接觀察到BQ染毒組細(xì)胞胞漿中存在較多的自噬體和少量的自噬溶酶體;自噬相關(guān)蛋白表達(dá)分析顯示BQ染毒組LC3和Beclin1蛋白表達(dá)增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增大，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明BQ能夠誘導(dǎo)