活性氧在藍(lán)萼甲素誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、背景與目的:藍(lán)萼香茶菜(Rabdosia japonica(Burm.f.)Haravar.glaucocalyx(Maxim.)Hara)為唇形科(Labiatae)香茶菜屬植物,具有健胃、清熱解毒、活血、抗菌消炎等活性,用于治療胃炎,脘腹脹痛,肝炎初期,感冒發(fā)熱,乳腺炎、關(guān)節(jié)痛等疾病。近年來,大量文獻(xiàn)報(bào)道香茶菜屬植物普遍具有抗腫瘤活性,貝殼杉烷形二萜類化合物是其活性成分。但藍(lán)萼香茶菜抗腫瘤活性研究卻鮮有報(bào)道。本文從體外水平研究了藍(lán)萼

2、香茶菜的主要二萜成分藍(lán)萼甲素(glaucocalyxin A；GLA)和藍(lán)萼丙素(glaucocalyxin C;GLC)的抗腫瘤作用。運(yùn)用多種方法檢測GLA和GLC誘導(dǎo)的凋亡,并對細(xì)胞凋亡的機(jī)制以及活性氧(reactive oxygen species；ROS)在GLA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行了深入研究。目前,中醫(yī)藥研究的發(fā)展趨勢為采用分子生物學(xué)手段對祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)寶庫中的中草藥進(jìn)行研究,對其藥理作用機(jī)制給予新的解釋,開發(fā)出新

3、的抗腫瘤藥物,弘揚(yáng)祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)。在這樣的前提下,深入探討藍(lán)萼甲素的抗腫瘤作用分子機(jī)制,是一項(xiàng)很有前景和研究價(jià)值的課題。
　　 方法:首先運(yùn)用MTT法比較了GLA和GLC的細(xì)胞毒作用。此外,我們運(yùn)用分子對接(autodock)技術(shù),以Bc1-2為靶蛋白,考察GLA或GLC與其結(jié)合能力；分別采用AO/EB雙染、DAPI染色、TUNEL法、DNA梯狀電泳法和AnnexinV-FITC/PI雙染方法,從細(xì)胞核形態(tài),生化指標(biāo)的變化檢測細(xì)胞

4、凋亡,并且利用流式細(xì)胞儀定量了凋亡率。分光光度法檢測了caspase3、8和9的活性。流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測了線粒體膜電位和ROS的爆發(fā)。氧電極法檢測了氧耗量,同時(shí)檢測了MDA的含量以及抗氧化酶(CAT和SOD)活性。免疫熒光法檢測了藍(lán)萼甲素對細(xì)胞色素C釋放的影響。免疫印跡法檢測了藍(lán)萼甲素對Bax和Bc1-2蛋白表達(dá)的影響。RT-PCR方法檢測了藍(lán)萼甲素對Fas基因表達(dá)的影響。同時(shí)利用MTT法,流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡檢測了抗氧化劑N

5、AC對藍(lán)萼甲素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果:GLA對所選擇的15個(gè)腫瘤細(xì)胞株均具有顯著的抗腫瘤活性,并呈現(xiàn)濃度依賴性效應(yīng),HL-60為其最敏感的細(xì)胞株,IC50僅為0.33μg/ml,而在所選的濃度下,GLC對15株腫瘤細(xì)胞均無作用。此外,分子對接(autodock)顯示,對接后GLA與Bc1-2蛋白的結(jié)合自由能和Ki值均低于GLC,說明GLA更易與Bc1-2結(jié)合從而抑制Bc1-2的功能,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。GLA可以誘

6、導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡,凋亡細(xì)胞百分率從7.80％(0μg/ml)上升到40.60％(10μg/ml),具有濃度依賴性效應(yīng),但是GLC對HL-60細(xì)胞沒有作用。GLA可以導(dǎo)致HL-60細(xì)胞MMP下降、ROS爆發(fā)、線粒體細(xì)胞色素C的釋放、Bax/Bc1-2上升,Fas基因上調(diào)以及caspase3、8和9活性升高?？寡趸瘎㎞AC抑制GLA誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生后,HL-60細(xì)胞的存活率,線粒體膜電位上升,細(xì)胞凋亡率下降。
　　 結(jié)論:本文實(shí)