細胞自噬在黑素細胞氧化應激中的作用.pdf

1、目的：黑素細胞氧化損傷涉及多種色素相關性皮膚病的發(fā)病機制，如白癜風、黑色素瘤等。黑素細胞由于其特殊的功能，以及所處的位置，極易受到內外環(huán)境誘導的氧化應激產(chǎn)生的過量活性氧簇造成的氧化損傷，活性氧簇能攻擊黑素細胞，干擾黑素細胞正常的代謝、增殖及分化，造成細胞線粒體功能受損、DNA破壞、蛋白修飾改變等，最終可導致黑素細胞惡性轉變或凋亡。細胞自噬是一種普遍存在于真核生物細胞內的，高度保守的依賴溶酶體的降解途徑，能降解大分子蛋白質、損傷的細胞器及

2、外來微生物等。近來大量研究證實細胞自噬與氧化應激關系密切，且發(fā)現(xiàn)多種氧化應激相關疾病的發(fā)病過程與自噬功能障礙密切相關，如心臟疾病、神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病、帕金森病等。但目前國內外目前對于細胞自噬與黑素細胞氧化損傷之間的關系還沒有研究透徹。因此本研究旨在通過檢測正常人黑素細胞氧化損傷時細胞自噬的變化，以及檢測細胞自噬對黑素細胞氧化損傷相關指標的影響，來初步探討自噬在黑素細胞氧化應激中扮演的角色。
　　方法：
　　1、從年齡

3、<10周歲的兒童包皮組織上分離正常人原代黑素細胞，將其與人黑素細胞系 PIG1進行培養(yǎng)：人原代黑素細胞、正常人黑素細胞系PIG1分別培養(yǎng)于254培養(yǎng)基中，放入37℃、含5％CO2的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基及漂浮細胞情況，一般隔2日或3日換液，待細胞貼壁生長達70%-80%時，以0.25%的胰酶消化傳代，用于后續(xù)實驗。
　　2、構建黑素細胞氧化應激模型：分別用1.0mM的 H2O2處理正常人原代黑素細胞和人黑素細胞系PIG1，處理

4、24小時后，用MTS法檢測細胞活性。
　　3、通過免疫印跡檢測黑素細胞氧化損傷下自噬相關蛋白P62、LC3的表達情況，并用激光共聚焦顯微鏡觀察氧化應激下黑素細胞內自噬小體的形成情況。
　　4、分別用自噬促進劑及自噬抑制劑預處理黑素細胞后，以流式細胞技術檢測黑素細胞氧化應激下細胞凋亡水平、細胞內ROS水平及線粒體膜電位的變化。
　　結果：1、原代黑素細胞在1.0mM H2O2處理24h后，細胞活性降低且差異具有統(tǒng)計學意義

5、（P<0.05）。
　　2、1.0mM H2O2處理黑素細胞后，黑素細胞自噬相關蛋白LC3II表達
　　逐漸增高，LC3I表達逐漸下降，蛋白 P62表達逐漸下降，自噬小體數(shù)量明顯增多。抑制黑素細胞自噬后，黑素細胞內ROS水平、細胞凋亡水平高于對照組，線粒體膜電位下降（P<0.05）；促進黑素細胞自噬后，黑素細胞內ROS水平、細胞凋亡水平低于對照組，線粒體膜電位增高（P<0.05）。
　　結論：
　　1、1.0mM