PP2A甲基化調(diào)控在細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用研究.pdf

1、目的:蛋白磷酸酶2A(PP2A)可以在亮氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(LCMT1)的催化作用下發(fā)生甲基化，在蛋白磷酸酶甲基酯酶1(PPME1)的催化作用下發(fā)生去甲基化，這種可逆性的甲基化作用在調(diào)控細(xì)胞生長代謝和有絲分裂中具有重要作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞氧化應(yīng)激可以引起PP2A甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，然而其中潛在的效應(yīng)關(guān)系和調(diào)控機理尚不明確。本研究通過構(gòu)建PPME1和LCMT1穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株，為后續(xù)從細(xì)胞和分子水平研究PP2A甲基化調(diào)控在細(xì)胞氧化

2、應(yīng)激中的作用提供有力的研究工具;并利用構(gòu)建好的LCMT1高表達(dá)細(xì)胞株，探討LCMT1高表達(dá)在細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用及其機制。
　　方法:
　　1、構(gòu)建PPME1及LCMT1高表達(dá)HEK293細(xì)胞株
　　(1)以pcDNA3.0和pEGFP-N1為載體分別構(gòu)建重組質(zhì)粒PPME1-pcDNA3.0、PPME1-pEGFP-N1、LCMT1-pcDNA3.0和LCMT1-pEGFP-N1;采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將這些重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

3、到HEK293細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株P(guān)PME1-293、PPME1-GFP-293、LCMT1-293和LCMT1-GFP-293，并轉(zhuǎn)染空載體做為對照組細(xì)胞株pcDNA3.0-293和pEGFP-N1-293。(2)采用熒光顯微鏡觀察PPME1-GFP和LCMT1-GFP熒光融合蛋白的表達(dá)并計算轉(zhuǎn)染效率;使用G418篩選陽性細(xì)胞;采用Q-PCR分析PPME1和LCMT1基因mRNA的表達(dá);采用Western Blot檢測PPME1(

4、或PPME1-GFP)和LCMT1（或LCMT1-GFP）及去甲基化PP2Ac蛋白的表達(dá)。(3)采用激光共聚焦顯微鏡觀察PPME1-GFP（或LCMT1-GFP）在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的分布情況。
　　2、研究LCMT1高表達(dá)在細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用及其機制
　　使用H2O2同時處理pcDNA3.0-293和LCMT1-293細(xì)胞誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激模型，采用刃天青法檢測兩株細(xì)胞在模型中的細(xì)胞活性變化;采用JC-1染料試劑盒檢測模型中

5、兩株細(xì)胞的線粒體膜電位變化;采用WesternBlot分析模型中兩株細(xì)胞去甲基化的PP2Ac、磷酸化的mTOR及其底物P70S6K1和4E-BP1等蛋白的表達(dá)情況;并使用PPME1特異性抑制劑AMZ-30和mTORC1通路特異性抑制劑Rapamycin對氧化應(yīng)激模型進(jìn)行處理以分析其中的分子調(diào)控機理。
　　結(jié)果:
　　1、PPME1及LCMT1高表達(dá)HEK293細(xì)胞株的構(gòu)建
　　(1)各細(xì)胞株P(guān)PME1或LCMT1蛋白的

6、表達(dá)檢測及其功能鑒定:PPME1-293（或PPME1-GFP-293）細(xì)胞內(nèi)PPME1（或PPME1-GFP）蛋白的表達(dá)量明顯高于對照組細(xì)胞pcDNA3.0-293（或pEGFP-N1-293），并且去甲基化PP2Ac蛋白的表達(dá)量也明顯高于對照組細(xì)胞的表達(dá)(P＜0.05)，提示高表達(dá)的PPME(或PPME1-GFP)蛋白具有催化PP2Ac去甲基化的功能;LCMT1-293(或LCMT1-GFP-293)細(xì)胞內(nèi)LCMT1（或LCMT1-

7、GFP）蛋白的表達(dá)量明顯高于對照組細(xì)胞pcDNA3.0-293（或pEGFP-N1-293），而去甲基化PP2Ac蛋白的表達(dá)量低于對照組細(xì)胞的表達(dá)(P＜0.05)，提示高表達(dá)的LCMT1（或LCMT1-GFP）蛋白具有催化PP2Ac甲基化的功能。
　　(2) PPME1-GFP和LCMT1-GFP融合蛋白核質(zhì)分布:PPME1-GFP融合蛋白主要分布在細(xì)胞核中，核質(zhì)比約為2.5∶1，與原生的PPME1在細(xì)胞內(nèi)的分布一致;LCMT1-

8、GFP融合蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，核質(zhì)比約為0.95∶1，與原生的LCMT1在細(xì)胞內(nèi)的分布一致。
　　2、LCMT1高表達(dá)在細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用及其機制研究1
　　(1) H2O2誘導(dǎo)PP2Ac去甲基化:H2O2可以誘導(dǎo)PP2Ac發(fā)生去甲基化，LCMT1高表達(dá)和PME-1抑制劑AMZ-30處理均能不同程度的抑制這種去甲基化作用。(2) LCMT1高表達(dá)拮抗H2O2對細(xì)胞的損傷作用:H2O2刺激對HEK293細(xì)胞的活性

9、具有損傷作用，使用AMZ-30預(yù)處理細(xì)胞不影響這種損傷作用;而相同濃度H2O2作用下，LCMT1-293的細(xì)胞活性明顯高于對照組細(xì)胞pcDNA3.0-293(P＜0.05)，提示LCMT1高表達(dá)拮抗H2O2對細(xì)胞的損傷作用。(3) LCMT1高表達(dá)保護(hù)mTORC1信號通路的磷酸化作用:Rapamycin和H2O2處理HEK293細(xì)胞均可以明顯抑制mTOR及其下游底物P70S6K1和4E-BP1的磷酸化作用;而相同濃度Rapamycin或

10、H2O2作用下，LCMT1-293細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白P-mTOR，P-P70S6K1和P-4E-BP1的表達(dá)水平要明顯高于pcDNA3.0-293細(xì)胞的表達(dá)(P＜0.05)，提示LCMT1高表達(dá)保護(hù)mTORC1信號通路的磷酸化作用。(4) LCMT1高表達(dá)保護(hù)細(xì)胞線粒體膜電位:相同濃度H2O2作用下，LCMT1-293細(xì)胞線粒體膜電位的喪失程度明顯小于對照組細(xì)胞pcDNA3.0-293的喪失程度(P＜0.05)，提示LCMT1高表達(dá)保護(hù)細(xì)

11、胞線粒體膜電位。
　　結(jié)論:(1)本研究成功構(gòu)建PPME1及LCMT1穩(wěn)定高表達(dá)的HEK293細(xì)胞株（即PPME1-293和LCMT1-293），以及帶熒光標(biāo)志GFP的PPME1及LCMT1穩(wěn)定高表達(dá)的HEK293細(xì)胞株(即PPME1-GFP-293和LCMT1-GFP-293)。(2)在氧化應(yīng)激條件下，LCMT1高表達(dá)可能通過調(diào)控PP2Ac甲基化保護(hù)mTOR及其下游底物P70S6K1和4E-BP1的磷酸化作用來保護(hù)細(xì)胞線粒體功能