氧化應(yīng)激在胰腺纖維化中的作用及其分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分氧化應(yīng)激在長期高脂飲食誘導(dǎo)的胰腺損傷中的作用 目的：探討長期高脂飲食對胰腺組織的影響及其機(jī)制。 結(jié)果：1．一般情況：20周末，HFD組大鼠體重明顯高于對照組(524.40士51.51，434.60士25.72，P=0.013)。兩組均無大鼠死亡，大鼠未出現(xiàn)腹瀉、多尿或消瘦等。局部解剖發(fā)現(xiàn)，HFD大鼠皮下、胃底及胰腺周圍有大量脂肪沉積。2．血液檢測：2周后，HFD大鼠出現(xiàn)高脂血癥。20周末，HFD大鼠血清TG、TC

2、H增高更明顯，而對照組大鼠血脂水平變化不大，兩組大鼠比較血清TG、TCH水平有顯著差異。3.胰腺活體微循環(huán)檢測和微血管密度觀察：HFD大鼠胰腺微血管血流速度(639.70±104.63¨m/s)較對照組大鼠降低15.39﹪(756.08±98.98μm/s)(P=0.008)。HFD大鼠胰腺微血管直徑較對照組大鼠增加(22.72±7.11μm，15.81±5.13μm，P=0.016)。高脂喂養(yǎng)大鼠胰腺微血管形態(tài)模糊，灌注差，有些微血管

3、不連續(xù)且微血管密度較對照組大鼠明顯降低(1.83±0.72，3.08±1.3 8，P=0.013)。4.H&E染色：光鏡下觀察，高脂飲食大鼠胰腺腺泡及胰島細(xì)胞萎縮、空泡變，小葉間隙增寬，小葉內(nèi)或小葉間有淋巴細(xì)胞浸潤。偶見有膠原纖維。5.透射電鏡觀察：HFD組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞核膜腫脹、模糊，核變小，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張；線粒體嵴模糊或消失：血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，內(nèi)皮細(xì)胞向腔內(nèi)指狀突起；內(nèi)皮細(xì)胞表面有破損，細(xì)胞間隙增寬，內(nèi)皮連續(xù)性局部中斷。內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)

4、質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹、嵴模糊。6.天狼猩紅染色：高脂喂養(yǎng)的大鼠胰腺組織內(nèi)有散在的膠原纖維，對照組大鼠未見膠原形成。7.免疫組化染色：高脂喂養(yǎng)大鼠胰腺組織可見NF-κB/p65、ICAM-1和α-SMA的強(qiáng)表達(dá)。8.MDA、SOD檢測：HFD組大鼠胰腺組織MDA含量(42.77±16.53nmol/mgprot)較對照組(9.89+：6.1 5 nmol/mgprot)顯著增高(P=0.022)而SOD活性(36.91士8.49LY/mg

5、prot)較對照組(91.87士41.35U/mgprot)降低(P=0.039)。9.RT-PCR：高脂飲食大鼠胰腺組織NF-κB/p65、ICAM-1、TNF-α和α-SMAmRNA水平均明顯高于正常飲食組。10.蛋白質(zhì)免疫印跡分析：高脂組大鼠胰腺組織NF-κB/p65、ICAM-1、α-SMA的表達(dá)顯著高于正常飲食組。 結(jié)論：長期高脂飲食引起胰腺組織細(xì)胞損傷和早期纖維化發(fā)生。這種損傷與胰腺組織內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)有關(guān)。氧化應(yīng)激增

6、強(qiáng)繼發(fā)于脂質(zhì)代謝紊亂和胰腺微循環(huán)障礙。其分子機(jī)制可能與NF-κB活化及其下游調(diào)節(jié)分子ICAM-1等的過表達(dá)有關(guān)。 第二部分ICAM-1在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠胰腺纖維化中的表達(dá)及其反義寡核苷酸的干預(yù)作用 目的：探討ICAM-1在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠胰腺纖維化中的作用及其反義寡核苷酸的干預(yù)作用。 結(jié)果：1．一般情況：大鼠腹腔注射雙蒸水、ASON和錯配ASON后均無不良反應(yīng)，但腹腔注射DDC后立即出現(xiàn)兩側(cè)腹部收縮、身體拉長

7、及步態(tài)不穩(wěn)等不良反應(yīng)，約15min后自行緩解。2．H&E染色：DDC組和錯配寡核苷酸組(Mix組)大鼠胰腺腺泡細(xì)胞和胰島細(xì)胞空泡變和萎縮明顯，胰腺內(nèi)由膠原纖維形成，小葉間隙增寬。血管、膽管周圍和小葉間有淋巴細(xì)胞浸潤。ASON組上述表現(xiàn)明顯減輕。對照組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)清晰未見空泡變。3．天狼猩紅染色：DDC組和錯配寡核苷酸組(Mix組)大鼠胰腺組織內(nèi)有明顯膠原纖維形成，ASON組大鼠有少量膠原，而正常對照組大鼠未見明顯膠原存在。定量檢測膠原面

8、積比，發(fā)現(xiàn)DDC組和Mix組膠原含量最高，而ASON和正常對照組膠原含量最少。4．免疫組化染色：DDC組和錯配寡核苷酸組(Mix組)大鼠胰腺組織ICAM-1和α-SMA高表達(dá)，ASON組低表達(dá)而正常對照組無α-SMA表達(dá)。5．RT-PCR：DDC組、Mix組大鼠胰腺組織ICAM-1、α-SMA和Con I mRNA水平均明顯高于正常對照組。ASON組則顯著低于DDC和Mix組。5．蛋白質(zhì)免疫印跡分析：DDC組、Mix兩組大鼠胰腺組織IC

9、AM-1、α-SMA水平明顯高于正常對照組；ASON組大鼠胰腺組織中ICAM-1、α-SMA水平與對照組比較無差別，而與DDC組比較則顯著降低。 結(jié)論：氧化應(yīng)激可引起胰腺纖維化損傷，其分子機(jī)制與胰腺組織ICAM-1表達(dá)上調(diào)有關(guān)；應(yīng)用ICAM-1的反義寡核苷酸可抑制胰腺星狀細(xì)胞活化和膠原形成，可有效保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰腺纖維化損傷。 第三部分NF-KB抑制劑柳氮磺胺吡啶對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠胰腺纖維化干預(yù)的研究 目的

10、：探討NF-KB抑制劑柳氮磺胺吡啶對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠胰腺組織損傷的保護(hù)和治療作用。 結(jié)果：1.一般情況：大鼠注射柳氮磺胺吡啶后出現(xiàn)尿黃，多于第二天消失。2.H&E染色：鏡下觀察，對照組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)清晰，而DDC組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞和胰島細(xì)胞空泡變和萎縮明顯，胰腺內(nèi)由膠原纖維形成，小葉間隙增寬。血管、膽管周圍和小葉間有少量淋巴細(xì)胞浸潤。DS1組稍有減輕，DS2組和DS3組則較DDC組明顯減輕。3.天狼猩紅染色： DDC組和DS1組

11、大鼠胰腺組織小葉間隙、膽管和血管周圍有明顯膠原纖維形成。而DS2、DS3組大鼠有少量膠原，正常對照組大鼠未見膠原形成。4.免疫組化：DDC組和DS1組兩組大鼠胰腺組織NF-κB/p65、ICAM-1和α-SMA高表達(dá)，而DS2、DS3組則呈現(xiàn)低表達(dá)。對照組大鼠未見α-SMA表達(dá)。5.PCR：結(jié)果顯示，DDC組、DS1組大鼠胰腺組織NF-κB/p65、ICAM-1、TNF-α和Con I mRNA水平均明顯高于正常對照組。DS2、DS3組

12、上述分子的mRNA水平較DDC組降低而與正常對照組比較無差別。6.免疫印跡：檢測結(jié)果顯示，DDC組、DS1兩組大鼠胰腺組織NF-κB/p65、ICAM-1、α-SMA水平明顯高于正常對照組；DS2、DS3組大鼠胰腺組織中NF-κB/p65、ICAM-1和α-SMA水平與對照組比較無差別，而與DDC、DS1組比較則顯著降低。 結(jié)論：柳氮磺胺吡啶通過抑制NF-κB活化及其下游調(diào)節(jié)分子的表達(dá)而對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰腺損傷有保護(hù)和治療作用。