Leptin對(duì)HUVECs的氧化應(yīng)激和增殖作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分 Leptin對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激以及增殖的影響 目的： 觀察Leptin對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的氧化應(yīng)激作用及增殖的影響。 方法： (1)取新生嬰兒臍帶，應(yīng)用Ⅱ型膠原酶消化分離培養(yǎng)HUVECs，并應(yīng)用Ⅷ因子抗體對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定； (2)應(yīng)用Leptin對(duì)HUVECs進(jìn)行干預(yù)后檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)水平的變化； (3)運(yùn)用MTT比色法測(cè)定leptin

2、及抑制劑對(duì)HUVECs增殖的影響，并分別測(cè)定增殖率及抑制率。 結(jié)果： (1)在體外經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化法分離培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)鑒定95％以上為內(nèi)皮細(xì)胞； (2)Leptin能顯著增加HUVECs內(nèi)活性氧簇的產(chǎn)量，(與對(duì)照組比較，P<0.01)，上述變化可以被NADPH氧化酶抑制劑一二苯基碘(DPI)和PKC抑制劑(PKC inhibitor)所抑制； (3)Leptin能顯著促進(jìn)HUVECs增殖，與對(duì)照組比較，

3、增殖率達(dá)36％，運(yùn)用DPI和PKC抑制劑可以明顯抑制leptin對(duì)HUVECs的增殖作用，DPI的抑制率達(dá)37％，PKC抑制劑的抑制率達(dá)43％，(與對(duì)照組比較，P均<0.01)。 結(jié)論： (1)體外消化分離培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞純度較高可以成功運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)； (2)Leptin能提高HUVECs內(nèi)ROS的產(chǎn)量，即leptin可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)； (3)Leptin可以通過(guò)PKC途徑提高ROS水平促

4、進(jìn)HUVECs增殖。 第二部分 Leptin對(duì)HUVECs的氧化應(yīng)激作用機(jī)制的研究 目的： 觀察leptin在誘發(fā)HUVECs的氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中，p-PKC以及NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基NOX2、NOX4 mRNA表達(dá)水平的變化以及二者之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討leptin誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激作用的機(jī)制。 方法： 分別應(yīng)用不同濃度的leptin以及不同抑制劑干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞，然后運(yùn)用Westernblo

5、tting法測(cè)細(xì)胞內(nèi)p-PKC水平，運(yùn)用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的NOX2-NOX4 mRNA的表達(dá)水平的變化。 結(jié)果： (1)Leptin能顯著增加HUVECs內(nèi)的p-PKC水平(與對(duì)照組比較，P<0.01)； (2)Leptin能促進(jìn)HUVECs中NADPH氧化酶NOX2、NOX4的mRNA的表達(dá)，上述變化可以被PKC抑制劑所抑制。 結(jié)論： (1)Leptin能顯著提高HUVECs內(nèi)p-PKC