ABCG2在氧化應(yīng)激中的保護(hù)作用及其可能機(jī)制研究.pdf

1、[背景與目的]
　　 ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)子(ATP-Binding Cassette Family G2 Transporters)亦稱乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistant protein，BCRP），是由ABC基因家族編碼的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABCG2基因定位于人類染色體4q22，編碼655個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜糖蛋白。該類蛋白均有ATP結(jié)合位點(diǎn)，通過水解ATP提供能量將底物逆勢(shì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜外或細(xì)胞器中，其

2、轉(zhuǎn)運(yùn)底物包括各種藥物/毒素及其代謝物、生理代謝物、營(yíng)養(yǎng)物、脂類和多肽等。眾多研究顯示，ABCG2在大多數(shù)正常組織中高表達(dá)，包括腦、腸道、肝、胎盤、生殖腺和骨髓等組織，從而保護(hù)這些組織免于藥物及毒物的影響，對(duì)維持人體正常生理功能和減輕病理損傷起著至關(guān)重要作用。本課題組多年來一直從事ABCG2的研究，并首次發(fā)現(xiàn)ABCG2具有保護(hù)細(xì)胞免受活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)的細(xì)胞損害的作用。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)

3、一步研究了ABCG2在ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中的作用及其可能涉及的信號(hào)通路，為深入探討ABCG2在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的保護(hù)作用及其可能機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)初步探究了ABCG2在阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)發(fā)病過程中的保護(hù)作用，以期進(jìn)一步明確AD的發(fā)病機(jī)制及為AD的預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1．ABCG2-pTT5SH8Q2重組質(zhì)粒的構(gòu)建、擴(kuò)增、鑒定及重組質(zhì)粒在

4、細(xì)胞內(nèi)（人胚腎上皮細(xì)胞HEK293及小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞株N2a-695）的表達(dá)和表達(dá)效率的鑒定（Western blot，免疫熒光）。(pTT5SH8Q2空載質(zhì)粒，以下簡(jiǎn)稱PTT)
　　 2．ROS assay及抗氧化能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)ABCG2在過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)和/或叔丁基過氧化氫（tert-Butyl hydroperoxide，TBHP）誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生及細(xì)胞抗氧化能力變

5、化過程中的作用。
　　 3．PI assay（Propidium Iodid，碘化丙啶）檢測(cè)ABCG2在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中的作用。
　　 4．RT-PCR及RT-qPCR檢測(cè)ABCG2對(duì)H2O2誘導(dǎo)的炎癥因子（IL-8，GRO或GRO-β）mRNA表達(dá)中的影響。ELISA進(jìn)一步檢測(cè)ABCG2在H2O2誘導(dǎo)的IL-8蛋白分泌中的影響。
　　 5．Western blot檢測(cè)ABCG2在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)NF

6、-κB信號(hào)通路中的作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中Western blot檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路在Abcg2基因敲除及野生型小鼠中的表達(dá)情況。
　　 6．血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)及ROS assay分別檢測(cè)ABCG2對(duì)氯化血紅素(hemin chloride)在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用及其對(duì)氯化血紅素誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生中的作用。
　　 7．Western blot檢測(cè)ABCG2在AD、AD合并腦淀粉樣變性血管病(cerebral amyloid angio

7、pathy，CAA)及年齡相仿的無癡呆(No dementia，ND)腦組織中的表達(dá)情況。
　　 8．活體掃描檢測(cè)ABCG2對(duì)β-淀粉樣蛋白1-40（amyloid peptide1-40，Aβ1-40）進(jìn)出Abcg2基因敲除小鼠及野生型小鼠血腦屏障的影響。免疫熒光進(jìn)一步檢測(cè)不同小鼠腦內(nèi)Aβ1-40的沉積情況。
　　 9．Western blot及RT-PCR分別檢測(cè)氧化應(yīng)激條件下，ABCG2對(duì)高表達(dá)β-淀粉樣前體蛋白（

8、amyloid precursor protein，APP）的N2a-695細(xì)胞中APP表達(dá)的影響。Aβ1-40ELISA進(jìn)一步檢測(cè)相同條件下，ABCG2對(duì)N2a-695細(xì)胞內(nèi)Aβ1-40產(chǎn)生的影響。
　　 10.分泌酶測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氧化應(yīng)激條件下，ABCG2對(duì)N2a-695細(xì)胞中α-，β-，γ-分泌酶活性的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 1．成功構(gòu)建ABCG2-PTT重組質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測(cè)序均證實(shí)質(zhì)粒

9、構(gòu)建成功，序列正確。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染ABCG2-PTT重組質(zhì)粒入HEK293及N2a-695細(xì)胞，Western blot提示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞48h后，ABCG2蛋白表達(dá)達(dá)到峰值。故本研究中，均在確保重組質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)48h后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。原位免疫熒光顯示該重組質(zhì)粒在兩種細(xì)胞中的表達(dá)效率均為60％以上。
　　 2.ROS assay實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未加H2O2的對(duì)照組(H2O)相比，H2O2(

10、0.5，1，2μM；2h)及TBHP(100μM;2h)均能明顯誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生（P＜0.05），而ABCG2能抑制這一過程中細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生（P＜0.05）；抗氧化能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ABCG2可增加H2O2(2μM;6h)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)下細(xì)胞的抗氧化能力（P＜0.05）。
　　 3．PI assay實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(H2O)相比，H2O2(0.5，1，2μM;2，6，16h)能誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞毒作

11、用(P＜0.001)，而ABCG2能抵抗H2O2(2μM;16h)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(P＜0.001)。
　　 4．RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(H2O)相比，H2O2(0.5，1，2μM；2，4，6h)明顯誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞中炎癥因子(IL-8，GRO)mRNA表達(dá)(P＜0.05)。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)，和對(duì)照組(H2O)相比，H2O2(0.5，1，2μM;6h)能明顯誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞中IL-8和GRO-β基

12、因的表達(dá)(P＜0.05)，而ABCG2能減少這一過程中IL-8、GRO-β的表達(dá)(P＜0.01)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果在蛋白水平進(jìn)一步證實(shí)，和對(duì)照組(H2O)相比，H2O2(1μM;6h)能明顯誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞中炎癥因子IL-8的分泌(P＜0.001)。與PTT空載處理組相比，ABCG2能夠明顯減少H2O2誘導(dǎo)的IL-8的分泌（P＜0.05）。
　　 5．Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(H2O)相比，H2O2(

13、0.5，1，2μM;2h)明顯誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的活化(P＜0.05)，而ABCG2能抑制細(xì)胞內(nèi)H2O2誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的活化（P＜0.01）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與野生型小鼠相比，Abcg2基因敲除小鼠的腦勻漿組織中，NF-κB信號(hào)通路活化顯著增多（P＜0.01）。
　　 6．血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ABCG2能夠減少血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞胞漿內(nèi)（P＜0.05）。ROS assay顯示血紅素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS

14、(P＜0.01)，而ABCG2通過減少血紅素進(jìn)入細(xì)胞而降低其誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(P＜0.001)。
　　 7．Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常年齡相仿的ND正常人腦組織相比，AD以及AD/CAA患者腦組織中ABCG2的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)。
　　 8．活體掃描實(shí)驗(yàn)結(jié)果及后續(xù)小鼠腦組織的免疫熒光結(jié)果均顯示，與野生型小鼠相比，Abcg2基因敲除小鼠腦內(nèi)Aβ1-40沉積明顯增加。提示ABCG2

15、能夠阻止Aβ1-40通過血腦屏障進(jìn)入小鼠腦內(nèi)（P＜0.05）。
　　 9，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2（2μM;4，6h）能夠誘導(dǎo)N2a-695細(xì)胞中APP的酶解（P＜0.05），而ABCG2可減少這一過程中N2a-695細(xì)胞內(nèi)APP的酶解(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，ABCG2對(duì)APP的基因表達(dá)無影響，因?yàn)锳PP基因已穩(wěn)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，故能持續(xù)高表達(dá)。Aβ1-40ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，ABCG2能

16、夠降低H2O2(1μM;4，6h)應(yīng)激所致N2a-695細(xì)胞中Aβ1-40的產(chǎn)生(P＜0.01)。
　　 10．分泌酶測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(H2O)相比，H2O2(0.5，1，2μM；6h)能明顯增加N2a-695細(xì)胞中a-，β-，γ-分泌酶的活性(P＜0.05)，而ABCG2能夠明顯減少氧化應(yīng)激條件下N2a-695細(xì)胞內(nèi)α-，β-，γ-分泌酶的活性(P＜0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1．ABCG2通

17、過抑制氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，增加細(xì)胞抗氧化能力，從而有助細(xì)胞抵抗ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用；同時(shí)亦能抑制氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞內(nèi)炎癥因子（IL-8，GRO）的表達(dá)及分泌(1L-8)，從而發(fā)揮其抗炎癥效應(yīng)。ABCG2能發(fā)揮上述保護(hù)作用的可能機(jī)理是ABCG2能減少作為其轉(zhuǎn)運(yùn)底物之一的血紅素（作為前氧化應(yīng)激因子）進(jìn)入細(xì)胞，從而減少血紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。
　　 2．體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ABCG2在氧化應(yīng)激中的保護(hù)作用可能是由NF-

18、κB信號(hào)通路介導(dǎo)的，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，ABCG2能抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。
　　 3．ABCG2在AD及CAA/AD患者腦內(nèi)高表達(dá)，推測(cè)ABCG2可能在AD病理生理過程中發(fā)揮保護(hù)作用，其中涉及的可能機(jī)制有：ABCG2作為血腦屏障上的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)子，可阻止Aβ1-40進(jìn)入血腦屏障，從而直接減少Aβ140在小鼠腦內(nèi)沉積：ABCG2通過減少氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞內(nèi)Aβ前體蛋白APP的酶解，降低參與APP酶解的分泌酶的活性，最終導(dǎo)致細(xì)胞分泌