Sonic hedgehog信號通路在皮層神經(jīng)元氧化應(yīng)激中的保護作用及機制研究.pdf

1、第一部分Sonic hedgehog 信號通路與皮層神經(jīng)元氧化應(yīng)激過程的相關(guān)性研究
　　 目的：研究氧化應(yīng)激過程中，皮層神經(jīng)元內(nèi)源性Sonic hedgehog 信號通路的變化及時空分布規(guī)律。
　　 方法：原代大鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)10天后，應(yīng)用100μmol/l 過氧化氫（H2O2）作用神經(jīng)元誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型，選取3h，6h,24h 三個作用時間點為檢測終點，用實時熒光定量PCR（Quantitative realtime

2、 PCR）的方法檢測Sonic hedgehog (SHH)信號通路中的關(guān)鍵分子SHH，PTCH1，GLI1的mRNA 水平，用免疫印跡法(Western blot)檢測上述時間點三者的蛋白水平，選取100μmol/l H2O2 處理24h后的皮層神經(jīng)元，用NSE和SHH兩種抗體進行免疫熒光雙標(biāo)，用共聚焦顯微鏡觀察SHH 蛋白在皮層神經(jīng)元內(nèi)的分布。
　　 結(jié)果：100μmol/l H2O2 處理3h 即可引起SHH，PTCH1，

3、GLI1 三者的表達均增高，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,其中mRNA 水平的高峰出現(xiàn)在6h，蛋白水平的高峰出現(xiàn)在24h，內(nèi)源性SHH的表達主要分布在皮層神經(jīng)元的細胞質(zhì)。
　　 結(jié)論：氧化應(yīng)激促進皮層神經(jīng)元內(nèi)源性Sonic hedgehog 信號通路的激活，其效應(yīng)具有時間依賴性，空間分布主要定位在細胞質(zhì)。
　　 第二部分Sonic hedgehog 信號通路在皮層神經(jīng)元氧化應(yīng)激中的意義
　　 目的：了解激活的Sonic

4、hedgehog 信號通路對氧化應(yīng)激中皮層神經(jīng)元存活的影響。
　　 方法：用100μmol/l H2O2 處理皮層神經(jīng)元24h 作為本實驗研究氧化應(yīng)激的細胞模型，選用特異性阻斷Sonic hedgehog的兩種藥物cyclopamine（20μmol/l）和5E1(10μg/ml)阻斷內(nèi)源性Sonic hedgehog 信號通路，將皮層神經(jīng)元按如下處理分為：對照組，100μmol/l H2O2組，20 μmol/lcyclopa

5、mine組，100μmol/l H2O2+20μmol/lcyclopamine組，100μmol/l H2O2+10 μmol/l 5E1組，24h后用MTT 方法檢測各組皮層神經(jīng)元的存活率。用重組的Sonic hedgehog 蛋白（SHH 3μg/ml）外源性激活Sonic hedgehog 信號通路，選用 cyclopamine 作為通路阻滯劑阻斷其作用，將皮層神經(jīng)元按如下處理分組:對照組，100μmol/l H2O2組，100

6、μmol/l H2O2+3 μg/mlSHH組，100μmol/l H2O2+20μmol/lcyclopamine組，24h后用MTT 法檢測不同分組的皮層神經(jīng)元的存活率，用流式細胞儀定量分析各組細胞凋亡率，用hoechst 染色觀察凋亡細胞形態(tài)。
　　 結(jié)果：在氧化應(yīng)激的情況下，加入cyclopamine或5E1 阻斷內(nèi)源性Sonic hedgehog 信號通路的激活,引起神經(jīng)元生存率相比單獨應(yīng)用H2O2組進一步下降，外源性

7、激活Sonic hedgehog 信號通路，可導(dǎo)致氧化應(yīng)激中的神經(jīng)元存活率增加，凋亡率下降，凋亡細胞核碎裂濃聚現(xiàn)象減少，該效應(yīng)在應(yīng)用cyclopamine 阻斷外源性SHH 蛋白作用后可被部分逆轉(zhuǎn)。
　　 結(jié)論：在氧化應(yīng)激中，Sonic hedgehog 信號通路的激活，參與保護皮層神經(jīng)元。
　　 第三部分氧化應(yīng)激下由Sonic hedgehog 信號通路介導(dǎo)的皮層神經(jīng)元保護因素的研究
　　 目的：研究氧化應(yīng)激下

8、激活Sonic hedgehog 信號通路后參與其神經(jīng)保護作用的相關(guān)因子變化。
　　 方法：將原代培養(yǎng)10天的皮層神經(jīng)元按如下處理分為對照組，100μmol/l H2O2組，100μmol/l H2O2+3μg/mlSHH組，100μmol/l H2O2+3μg/mlSHH+20μmol/lcyclopamine組，用DHE 探針檢測各組ROS 含量，用SOD,MDA,GSH-Px,LDH 試劑盒分別檢測各組細胞內(nèi)和培養(yǎng)基中相關(guān)

9、物質(zhì)的含量，用Western blot和Quantitative realtime PCR的方法檢測凋亡相關(guān)分子Bcl-2和Bax的表達，用ELISA 試劑盒和Quantitative realtimePCR的方法檢測神經(jīng)保護因子VEGF和BDNF的含量。
　　 結(jié)果：外源性激活Sonic hedgehog 信號通路后，皮層神經(jīng)元在氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的ROS含量降低，抗氧化應(yīng)激的保護因子SOD,GSH-PX 含量升高，細胞受損指標(biāo)M

10、DA,LDH 含量下降，抗凋亡因子Bcl-2表達增加,促凋亡因子Bax表達降低，神經(jīng)保護因子VEGF,BDNF表達均增加，cyclopamine 阻斷Sonic hedgehog 信號通路后，上述效應(yīng)均被減弱，以上結(jié)果經(jīng)分析后具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：氧化應(yīng)激中Sonic hedgehog 信號通路激活后，通過多種因素，包括調(diào)節(jié)氧化還原系統(tǒng)，減少應(yīng)激有毒產(chǎn)物的合成，增加抗氧化應(yīng)激物質(zhì)的含量，提高抗凋亡因子/凋亡因子的比例，增

11、加神經(jīng)保護因子的表達，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　 第四部分氧化應(yīng)激中與Sonic hedgehog 信號通路相關(guān)信號途徑的研究
　　 目的：研究在氧化應(yīng)激中參與Sonic hedgehog 信號通路神經(jīng)保護作用的信號途徑，進一步探求其分子機制。
　　 方法：將原代培養(yǎng)的神經(jīng)元分為四組,分別為：對照組，100μmol/l H2O2組，100μmol/lH2O2+3μg/mlSHH組，100μmol/l H2O2+3μ

12、g/mlSHH+20μmol/lcyclopamine組，針對三條信號途徑：ERK,PI3K/Akt,p38MAPK，用Western blot 方法分別檢測反映通路活化的關(guān)鍵分子p-ERK,p-Akt,p-p38 蛋白含量的變化。選擇特異性阻斷劑LY294002（20μmol/l）阻斷PI3K/Akt 信號途徑,將細胞分組如下：對照組，100μmol/l H2O2組,100μmol/l H2O2+3μg/mlSHH,100μmol/l

13、 H2O2+3μg/mlSHH+20μmol/lcyclopamine組,100μmol/l H2O2+3μg/mlSHH+20μmol/l LY294002組，用MTT的方法檢測細胞存活率,用流式細胞儀檢測細胞凋亡，用western blot 檢測Bcl-2,Bax表達水平的變化。
　　 結(jié)果：氧化應(yīng)激中外源性激活Sonic hedgehog 信號通路后，p-Akt表達水平升高，p-ERK表達水平降低，p38MAPK表達水平無

14、明顯改變，阻斷Sonic hedgehog 信號通路或阻斷PI3K/Akt 信號途徑后，神經(jīng)元存活率降低，凋亡率增加，抗凋亡因子Bcl-2表達降低，促凋亡因子Bax表達增加，與外源性激活Sonic hedgehog 信號通路的效應(yīng)相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：Sonic hedgehog 信號通路活化涉及激活PI3K/Akt 信號途徑和抑制ERK 信號途徑，PI3K/Akt 信號途徑可能是Sonic hedgehog 信號