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文檔簡(jiǎn)介
1、前言
近視發(fā)病機(jī)制至今未完全明確,目前公認(rèn)的近視發(fā)病機(jī)制之一是外界因素刺激了視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜中的某些調(diào)控因子,影響了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(trans-forming growth factor-β,TGF-β)等生物活性物質(zhì)的平衡狀態(tài),導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)活性增加,造成鞏膜組織松解、眼軸增長(zhǎng)而產(chǎn)生近視。因此尋找確切的信號(hào)調(diào)控因子已成為近視發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)。已有研究和我們的
2、前期實(shí)驗(yàn)均提示Sonic hedgehog(Shh)可能作為一種視網(wǎng)膜重要信號(hào)因子參與了眼軸的生長(zhǎng)導(dǎo)致近視形成。同時(shí)眼外研究中發(fā)現(xiàn)Shh信號(hào)通路可調(diào)控MMPs、TGF-β等活性因子的表達(dá),亦提示上游視網(wǎng)膜Shh信號(hào)通路在近視發(fā)展過(guò)程中可能的下游通路。因此我們采用豚鼠的形覺(jué)剝奪性近視模型,通過(guò)外源性Shh-N玻璃體腔注射上調(diào)及特異性抑制劑cyclopamine抑制Shh表達(dá),檢測(cè)Shh表達(dá)與TGF-β、MMP-2等生物活性因子改變的關(guān)系,
3、探索Shh信號(hào)因子對(duì)近視調(diào)控的作用和具體調(diào)控途徑,為近視眼防治提供依據(jù)。
第一部分:豚鼠形覺(jué)剝奪性近視眼視網(wǎng)膜Shh信號(hào)通路和鞏膜MMP-2、TGF-β表達(dá)變化
目的:在豚鼠形覺(jué)剝奪性近視模型(form-deprivation myopia,F(xiàn)DM)中檢測(cè)視網(wǎng)膜Shh及相關(guān)下游因子的表達(dá)變化,觀察鞏膜中MMF-2和TGF-β含量的改變。
方法:56只2-3周齡三色健康豚鼠隨機(jī)分為FDM組(n=4
4、0)和空白對(duì)照組(control組)(n=16)。FDM組右眼眼周黏貼半透明薄膜,左眼及control組不作任何處理。FDM組和control組分別于形覺(jué)剝奪0周、1周、2周及4周取10只和4只豚鼠進(jìn)行檢影驗(yàn)光及眼軸長(zhǎng)度等生物學(xué)測(cè)量后,處死取眼球行免疫熒光染色檢測(cè)視網(wǎng)膜Shh、受體Ptc-1以及核轉(zhuǎn)錄因子Gli-3表達(dá)水平,實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative revers
5、etranscription polymerase chain reaction,real-time PCR)檢測(cè)視網(wǎng)膜Shh、Ptc-1以及Gli-3mRNA水平變化,Western-blot檢測(cè)視網(wǎng)膜Shh蛋白表達(dá)水平及鞏膜組織中MMP-2、TGF-β的表達(dá)變化。
結(jié)果:形覺(jué)剝奪1周、2周及4周后,F(xiàn)DM組遮蓋眼較對(duì)側(cè)眼分別誘導(dǎo)出-2.35±1.10D、-5.13±1.73D及-6.78±1.04D的相對(duì)近視,且隨著剝
6、奪時(shí)間的延長(zhǎng),近視程度加劇。形覺(jué)剝奪1周、2周及4周后,F(xiàn)DM組誘導(dǎo)出的相對(duì)眼軸分別延長(zhǎng)0.1±0.05mm、0.11±0.04mm和0.37±0.19mm,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。形覺(jué)剝奪1周、2周及4周后,F(xiàn)DM組誘導(dǎo)出的相對(duì)玻璃體腔長(zhǎng)度分別延長(zhǎng)0.07±0.04mm、0.10±0.07mm和0.36±0.18mm,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫熒光染色顯示,Shh彌漫表達(dá)于豚鼠視網(wǎng)膜各層;Ptc-1和Gli-3均表達(dá)于豚鼠視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞
7、胞漿內(nèi)。形覺(jué)剝奪4周時(shí),F(xiàn)DM組中遮蓋眼較對(duì)側(cè)眼ShhmRNA和Ptc-1mRNA表達(dá)水平明顯增加(P值分別為0.043和0.024)。Western結(jié)果顯示,形覺(jué)剝奪2周開始,遮蓋眼的Shh蛋白表達(dá)水平開始較左眼升高;遮蓋眼鞏膜MMP-2在剝奪2周后開始明顯升高,而TGF-β表達(dá)水平下降,并持續(xù)至4周。
結(jié)論:在半透明薄膜法誘導(dǎo)的豚鼠FDM中,伴隨視網(wǎng)膜組織Shh及Ptc-1表達(dá)水平升高,以及鞏膜MMP-2表達(dá)上升和TG
8、F-β表達(dá)下降,提示Shh信號(hào)通路可能參與了豚鼠FDM的調(diào)控過(guò)程。
第二部分:玻璃體腔內(nèi)注射Sonic hedgehog溶液對(duì)豚鼠近視發(fā)生發(fā)展的作用及相關(guān)機(jī)制研究
目的:通過(guò)外源性玻璃體腔內(nèi)注射Shh溶液來(lái)觀察豚鼠近視發(fā)生發(fā)展及鞏膜組織中MMP-2、TGF-β表達(dá)水平的變化。
方法:將出生2-3周齡三色健康豚鼠40只隨機(jī)分為2組,每組20只。每組的右眼進(jìn)行Shh-N/0.1%牛血清蛋白(bovi
9、ne serum albumin,BSA)注射,左眼進(jìn)行0.1%BSA注射。雙眼依次進(jìn)行,隔2天注射一次,每次每只眼球注射10μl,共注射4次。兩組的Shh-N注藥濃度分別為20μg/ml(Shh20組)和50μg/ml(Shh50組)。在注藥的第14天(2周)進(jìn)行驗(yàn)光和眼軸等生物學(xué)測(cè)量后,處死取眼球行石蠟切片HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)變化,取鞏膜組織進(jìn)行Western-Blot檢測(cè)MMP-2和TGF-β蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與第一部分FDM組
10、2周(FDM2W)和Conrtrol組2周(Control2W)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。
結(jié)果:豚鼠玻璃體腔內(nèi)注射Shh-N20μg/ml及50μg/ml分別誘導(dǎo)豚鼠出現(xiàn)-1.54±0.75D和-4.04±1.48D的相對(duì)近視;0.11±0.09mm和0.14±0.03mm的相對(duì)眼軸延長(zhǎng);以及0.1±0.09mm和0.13±0.03mm的相對(duì)玻璃體腔長(zhǎng)度延長(zhǎng):差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Shh50組較Shh20注藥組誘導(dǎo)出更深的相對(duì)近視度數(shù)
11、(P<0.001)及眼軸長(zhǎng)度(P=0.0019)。Western-blot結(jié)果顯示,璃體腔內(nèi)注射Shh-N可使鞏膜組織MMP-2表達(dá)水平明顯上升,但Shh20組和Shh50組間表達(dá)未表現(xiàn)出明顯的差異;TGF-β表達(dá)水平未見明顯差異。
結(jié)論:豚鼠玻璃體腔內(nèi)注射Shh-N可促進(jìn)眼球向近視方向發(fā)展及眼軸延長(zhǎng),并且促進(jìn)近視程度與注射的藥物呈一定濃度梯度;Shh-N注射后可導(dǎo)致鞏膜組織中MMP-2表達(dá)明顯上調(diào),提示Shh信號(hào)通路通過(guò)
12、上調(diào)MMP-2表達(dá)水平,參與鞏膜重塑,眼軸增長(zhǎng),最終出現(xiàn)近視。
第三部分:玻璃體腔內(nèi)注射Shh特異性抑制劑Cyclopamine對(duì)豚鼠形覺(jué)剝奪性近視發(fā)生發(fā)展的作用及相關(guān)機(jī)制研究
目的:在FDM豚鼠玻璃體腔注射Cyclopamine以觀察其對(duì)近視發(fā)展抑制的作用,同時(shí)觀察下游鞏膜中MMP-2及TGF-β表達(dá)水平的變化,進(jìn)一步探究Shh作用的下游鞏膜機(jī)制
方法:將出生2-3周齡三色健康豚鼠60只隨機(jī)分
13、為3組,每組20只。每組的右眼進(jìn)行半透明薄膜遮蓋,同時(shí)雙眼進(jìn)行相同濃度cyclopamine注射。雙眼依次進(jìn)行玻璃體腔內(nèi)注射,隔2天注射一次,每次每只眼球注射10μl,共注射4次。3組的cyclopamine注藥濃度分別為50μg/ml(FDM50組)、100μg/ml(FDM100組)及200μg/ml(FDM200組)。在注藥的第14天(2周)進(jìn)行驗(yàn)光和眼軸等生物學(xué)測(cè)量后,處死取眼球行石蠟切片HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)變化,取鞏膜組織進(jìn)
14、行Western-Blot檢測(cè)MMP-2和TGF-β蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與第一部分FDM組2周(FDM2W)和Conrtrol組2周(Control2W)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。
結(jié)果:FDM50組、FDM100組及FDM200組遮蓋眼較對(duì)側(cè)眼分別出現(xiàn)了-2.69±1.15D、-1.46±0.91D和-0.38±0.81D的相對(duì)近視;豚鼠玻璃體腔內(nèi)注射cyclopamine均能抑制豚鼠FDM的形成,F(xiàn)DM200組較FDM50組在程度上
15、更能抑制形覺(jué)剝奪性近視的形成(P<0.0001)。FDM50組、FDM100組及FDM200組遮蓋眼較對(duì)側(cè)眼分別出現(xiàn)了0.09±0.05mm、0.06±0.04mm和0.04±0.02mm的相對(duì)眼軸延長(zhǎng);FDM100組和FDM200組均抑制了部分形覺(jué)剝奪引起的相對(duì)眼軸延長(zhǎng)(PFDM100=0.044,PFDM200=0.001)。FDM50組、FDM100組及FDM200組遮蓋眼較對(duì)側(cè)眼分別出現(xiàn)了0.09±0.05mm、0.07±0.0
16、5mm和0.04±0.05mm的相對(duì)玻璃體腔延長(zhǎng)。FDM200組較FDM2W組和FDMSO組更能抑制部分形覺(jué)剝奪引起的相對(duì)玻璃體腔長(zhǎng)度延長(zhǎng)(P值分別為0.0446和0.0388)。鞏膜組織western-blot結(jié)果顯示,右眼的FDM2W組和FDM50組的MMP-2水平表達(dá)相當(dāng),均較對(duì)側(cè)眼明顯上調(diào),但FDM100組和FDM200組的MMP-2水平較FDM2W組和FDM50組明顯下調(diào)。
結(jié)論:玻璃體腔內(nèi)注射Shh特異性抑制劑
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