視黃酸對豚鼠近視眼視網膜色素上皮—脈絡膜復合體作用的相關研究.pdf

1、第一章：RA和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin在豚鼠離焦型近視眼視網膜色素上皮-脈絡膜復合體中的表達
　　目的:通過建立豚鼠離焦型近視模型，觀察視黃酸(RA)、緊密連接蛋白ZO-1和Occludin在視網膜色素上皮(RPE)-脈絡膜復合體中的動態(tài)表達變化，探討豚鼠近視眼中RA、ZO-1、Occludin在近視眼中可能的調控作用。
　　方法:取3周齡三色豚鼠（體重約150-180g）30只（雌雄不限），隨機分為A組:正常

2、組(n=15)，豚鼠雙眼均不佩戴鏡片;B組:離焦組(n=15)，豚鼠右眼均佩戴-6.00D的凹透鏡作為實驗眼，左眼均不佩戴鏡片作為自身對照眼。分別于實驗前、實驗第3天、第7天、第14天均對各組豚鼠進行屈光度、眼軸的檢測，并在相應時間點取視網膜色素上皮-脈絡膜復合體組織用高效液相色譜分析儀檢測其RA的含量，用Real-time PCR技術檢測緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA含量，Western blot技術檢測緊密連接蛋白

3、ZO-1、Occludin的蛋白含量，同時利用免疫熒光技術觀察其表達部位。
　　結果:1、屈光度和眼軸變化:隨著離焦時間的延長，A組豚鼠雙眼屈光度均呈正視化方向發(fā)展，眼軸呈正常生長發(fā)育速度增長，各時間點雙眼屈光度、眼軸長度比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。B組實驗眼呈明顯近視漂移，離焦第14天時誘導出相對近視約4.70D，實驗眼與自身對照眼屈光度比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);實驗眼相對自身對照眼眼軸增長速度加快，離

4、焦第14天時實驗眼（8.18±0.09mm）與自身對照眼（7.68±0.06mm）眼軸長度比較差異最大，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各時間點正常組與自身對照眼比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2、視黃酸表達變化:視黃酸在豚鼠實驗眼視網膜色素上皮-脈絡膜復合體上的表達隨離焦時間延長而上調，實驗眼在離焦第14天表達最高，表達量為137.85±1.02ng/100mg，其與自身對照眼（12.67±0.40ng/100mg）

5、比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各時間點正常組與自身對照眼比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3、緊密連接蛋白表達變化:緊密連接蛋白ZO-1、Occludin在豚鼠實驗眼視網膜色素上皮-脈絡膜復合體中的mRNA和蛋白表達均隨離焦時間延長而上調，在離焦第14天表達最高，其與正常組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各時間點正常組與自身對照眼比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。免疫熒光檢測顯示ZO-1、Occl

6、udin主要表達于RPE-脈絡膜復合體組織的RPE層，其熒光表達結果變化趨勢與Real-time PCR和Western Blot檢測結果相符。
　　結論:通過給豚鼠佩戴-6.00D凹透鏡可以成功建立離焦型近視模型;視黃酸在豚鼠離焦型近視的發(fā)展過程中表達上調;緊密連接蛋白ZO-1、Occludin隨離焦時間延長表達上調，可能參與了近視的形成和發(fā)展。
　　第二章：RA受體拮抗劑LE540對豚鼠離焦型近視眼視網膜色素上皮-脈絡膜

7、復合體中視黃酸和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的影響
　　目的:觀察LE540對豚鼠離焦型近視眼視網膜色素上皮-脈絡膜復合體中視黃酸以及緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達的影響，探討視黃酸與緊密連接蛋白ZO-1、Occludin之間可能的調控關系。
　　方法:取3周齡三色豚鼠（體重約150-180g）90只（雌雄不限），隨機分為A組:正常組(n=15):豚鼠雙眼均不佩戴鏡片，且不予任何藥物干預;B組:離焦組(

8、n=15)，豚鼠右眼均佩戴-6.00D凹透鏡，左眼均不佩戴鏡片，雙眼均不予任何藥物干預;C組:陰性對照組(n=15)，豚鼠右眼均佩戴-6.00D凹透鏡，同時予玻璃體腔內注射PBS5μL;D組:藥物干預組(n=45)，豚鼠右眼均佩戴-6.00D凹透鏡，同時予玻璃體腔內注射不同濃度RA受體拮抗劑LE540，根據(jù)LE540注射的不同濃度將D組分為D1組:10μM注射組(n=15); D2組:50μM注射組(n=15); D3組:100μM注射

9、組(n=15)。以上各組左眼均為自身對照眼。在實驗前、實驗第3天、第7天、第14天對以上各組豚鼠進行屈光度、眼軸的檢測，并在相應時間點取視網膜色素上皮-脈絡膜復合體用高效液相色譜分析儀檢測其RA的含量，在D1、D2、D3組中根據(jù)視網膜色素上皮復合體中RA含量的變化及對屈光度和眼軸長度的影響，選擇藥物干預后對豚鼠離焦型近視影響最明顯的組別作為D組，運用Real-time PCR技術檢測A、B、C、D組緊密連接蛋白ZO-1、Occludin

10、的mRNA含量，Western blot技術檢測各組緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的蛋白含量，同時利用免疫熒光技術觀察其表達部位及表達強度。
　　結果:1、屈光度和眼軸變化:A組豚鼠雙眼屈光度均呈正視化發(fā)展，雙眼眼軸呈正常生長發(fā)育速度增長，各時間點雙眼屈光度、眼軸長度比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。B組豚鼠右眼屈光度呈明顯近視漂移，右眼相對左眼眼軸增長速度加快，實驗第7天、第14天右眼分別與正常組以及左眼屈光度及眼

11、軸比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);C組雙眼屈光度及眼軸變化與B組一致，比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);D組隨離焦時間的延長，豚鼠各組右眼屈光度近視漂移、眼軸增長趨勢隨LE540注射濃度的不同均被不同程度抑制，其中在D2(50μM)組抑制趨勢最為明顯。而各時間點自身對照眼屈光度和眼軸與正常組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2、LE540對視網膜色素上皮-脈絡膜復合體中RA表達的影響:A組豚鼠雙眼RA表達在各時

12、間點均無明顯差異，比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。B組豚鼠右眼RA隨離焦時間延長表達上調。C組豚鼠右眼RA表達變化與B組表達變化趨勢一致，比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。D組豚鼠右眼玻璃體腔注射不同濃度RA受體拮抗劑LE540后，各組RA表達上調趨勢隨LE540注射濃度的不同均受到不同程度抑制，其中D2組抑制作用最明顯。各時間點自身對照眼視黃酸表達與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3、LE540對視網膜色

13、素上皮-脈絡膜復合體中緊密連接蛋白的影響:A組豚鼠雙眼緊密連接蛋白ZO-1、Occludin隨離焦時間延長無明顯變化。B組豚鼠右眼緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA和蛋白表達隨離焦時間延長而上調，左眼自身對照眼表達均無明顯變化。C組豚鼠雙眼緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達變化與B組相近。D組豚鼠右眼玻璃體腔注射不同濃度RA受體拮抗劑LE540后，各組緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA和蛋白表達上調趨