電場對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞作用的實驗研究.pdf

1、【背景】
　　組織的損傷修復(fù)對于維持組織正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，在這一過程中，電場可能發(fā)揮著不容忽視的作用。當(dāng)上皮細胞層受到破壞時，跨細胞層的離子流驅(qū)動電流流出，形成局部內(nèi)源性電場。已證實多種細胞能夠在與這種內(nèi)源性電場大小相當(dāng)?shù)耐饧又绷麟妶鲋谐尸F(xiàn)生物學(xué)特性的變化，尤其以移行能力的變化最為顯著。研究顯示，多種屬、多組織來源的細胞在電場作用下可出現(xiàn)向陰極或陽極方向的定向移行，即具有趨電性；電場可明顯促進皮膚、角膜上皮損傷的修復(fù)。因此，

2、電場可能作為細胞移行的重要刺激因素參與損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)。
　　目前關(guān)于電場對細胞作用的機制仍處于探索中，一些研究認為細胞骨架蛋白和細胞膜表面生長因子受體的不對稱分布、相關(guān)第二信使的激活均可能參與其中。在另一方面，細胞與細胞外基質(zhì)(cell-extracellularmatrix,ECM)間的粘附和相互作用是移行過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而整合素家族在該過程中至關(guān)重要。整合素是細胞表面兼具粘附和信號傳導(dǎo)功能的受體，通過胞外域與ECM、胞內(nèi)域與

3、信號傳導(dǎo)分子結(jié)合，介導(dǎo)了細胞內(nèi)外之間的雙向信號傳導(dǎo)，在調(diào)節(jié)細胞粘附、遷移、增生、分化等方面發(fā)揮重要作用。局部粘附激酶(focaladhesionkinase,FAK)是細胞內(nèi)一種非受體型酪氨酸激酶，是整合素介導(dǎo)的胞外-胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的基礎(chǔ)性信號傳遞分子。它與整合素受體相連接并聚集其它分子于連接位點，形成信號復(fù)合體，將細胞外信號向細胞骨架傳遞，調(diào)節(jié)細胞的粘附、移行。PTEN(phosphataseandtensinhomologuede

4、letedonchromosome10)為一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，能對FAK及其信號通路中多種信號分子進行脫磷酸調(diào)節(jié)，影響其正常細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致細胞局部粘附和運動遷移功能受到抑制。了解整合素及其相關(guān)信號通路在電場中的變化情況有望為深入理解電場作用的機制開辟新領(lǐng)域。
　　視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)位于視網(wǎng)膜光感受器細胞與Bruch膜之間，是維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，RPE損傷

5、相關(guān)的病變可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪失。然而RPE細胞所處位置的特殊性，使它易于同時受到神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的雙重影響，同時由于各種外來干擾措施不易直接對其產(chǎn)生作用，因此造成相關(guān)疾病的治療面臨重重困難。
　　在與RPE損傷相關(guān)的疾病中，年齡相關(guān)性黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)是患病率較高且危害較大的一種。AMD是50歲以上人群中視力障礙的主要原因，并隨著人口老齡化趨勢，該疾病的高危人群數(shù)量還

6、在迅速擴大。AMD的發(fā)病中，在物質(zhì)代謝異常、細胞功能變化、遺傳和環(huán)境等因素的共同作用下，黃斑區(qū)脈絡(luò)膜毛細血管、Bruch膜、RPE和光感受器細胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生慢性進行性改變。由于發(fā)病機制復(fù)雜，目前針對AMD的各種治療措施效果均十分有限。分析AMD的組織病理學(xué)特點，認為其治療關(guān)鍵在于促進病變區(qū)受損RPE細胞正常組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。結(jié)合電場在其它組織損傷修復(fù)中的作用，推測可以將電場引入對RPE細胞誘導(dǎo)和AMD治療的研究中來。
　　【目的

7、】
　　建立電場對人RPE(hRPE)細胞的體外作用模型，觀察電場對hRPE細胞生物學(xué)活性、移行、增生的影響，并檢測此過程中整合素、FAK信號通路的變化以及PTEN基因?qū)ι鲜鐾返恼{(diào)節(jié)作用。
　　【方法】
　　1)原代培養(yǎng)hRPE細胞，并根據(jù)文獻描述建立電場對hRPE細胞的作用模型；細胞暴露于電場強度為0～10V/cm的電場中，顯微照相系統(tǒng)記錄電場作用前、作用3h及停止作用后12h的細胞圖像；利用臺盼藍拒染活細胞計數(shù)法

8、計算各時間點活細胞率；細胞核仁組成區(qū)嗜銀蛋白(AgNORs)染色法計數(shù)細胞核內(nèi)AgNORs顆粒數(shù)目；流式細胞儀檢測各時間點細胞凋亡情況。
　　2)觀察電場對細胞移行的影響：hRPE細胞接受電場作用，選取電場強度分別為2、4、6、8、10V/cm，作用時間為3h，細胞分為無血清培養(yǎng)液組、無血清培養(yǎng)液+表皮生長因子(EGF)組、正常培養(yǎng)液組及正常培養(yǎng)液+EGF組。另選取部分正常培養(yǎng)液組細胞，于6V/cm電場強度中暴露3h后轉(zhuǎn)換電極方向

9、，繼續(xù)暴露3h。顯微照相系統(tǒng)連續(xù)記錄每15min細胞圖像，標(biāo)記每個觀察細胞核的中心，測量細胞移行距離、細胞移行方向與場線間的夾角，追蹤細胞位移，用cosineФ描述細胞移行方向。觀察參數(shù)包括：平均cosineФ、平均移行距離、平均移行速度、實際移行速度及移行指數(shù)。觀察電場對細胞增生的影響：電場作用條件為6V/cm、12h，計數(shù)電場作用前后hRPE細胞的細胞密度、細胞生長速度；流式細胞儀測定細胞周期；采用Westernblot檢測細胞內(nèi)c

10、yclinE的表達情況。
　　3)電場作用條件為6V/cm、3h，細胞松弛素B作為抑制劑，電場作用前與正常hRPE細胞共培養(yǎng)30min；免疫熒光染色方法檢測正常hRPE細胞和細胞松弛素B處理細胞內(nèi)F-actin、β1integrin在電場作用前后的分布情況；RT-PCR、Westernblot方法分別檢測電場作用前后細胞內(nèi)β1integrin的mRNA和蛋白含量變化；Westernblot方法檢測細胞內(nèi)FAK、pFAK(phosp

11、horylatedFAK)蛋白含量。
　　4)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PTEN的真核表達載體及其空載體轉(zhuǎn)染hRPE細胞，經(jīng)G418篩選(濃度為400mg/L)后獲得穩(wěn)定的克隆并進行鑒定；挑選細胞克隆擴大培養(yǎng)，接受電場作用，作用條件與第二部分實驗相同；記錄每15min細胞圖像，標(biāo)記每個觀察細胞核的中心，測量細胞移行距離、細胞移行方向與場線間的夾角，追蹤細胞位移，用cosineФ描述細胞移行方向；采用流式細胞儀測定電場作用前后的細胞周期；采

12、用Westernblot方法檢測電場作用前后轉(zhuǎn)染細胞中FAK、pFAK的表達。
　　【結(jié)果】
　　1)成功建立了電場對hRPE細胞的作用模型，各電場參數(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好。電場強度小于2V/cm的電場暴露對hRPE細胞的形態(tài)無明顯影響。暴露于2～10V/cm的電場后，hRPE細胞胞體伸長、細胞長軸垂直于場線方向排列；細胞暴露于電場3h后停止作用，繼續(xù)培養(yǎng)12h，細胞恢復(fù)正常狀態(tài)下的多角形或不規(guī)則形。臺盼藍和AgNORs染色顯示各

13、電場強度下各組細胞平均活細胞率和AgNORs顆粒數(shù)無顯著差別(P>0.05)。流式細胞儀檢測分析，電場作用前后hRPE細胞均未出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。
　　2)未受電場作用的正常對照組細胞隨機分布，平均cosineФ值為0.02±0.10。電場作用后，hRPE細胞出現(xiàn)朝向電場陰極方向的定向移行，此現(xiàn)象隨電場作用時間的延長和電場強度的升高更為明顯，平均cosineФ值持續(xù)增大并趨近于1。血清能夠影響hRPE細胞在電場中的定向移行。無血清

14、培養(yǎng)液組中，電場強度低于6V/cm時細胞無明顯的形態(tài)及移行變化，在6V/cm電場強度中方出現(xiàn)朝向垂直于場線方向的轉(zhuǎn)位及微弱的陰極方向位移，平均cosineФ值為0.21±0.13。正常培養(yǎng)液組中，6V/cm電場強度中細胞出現(xiàn)明顯的陰極方向移行趨勢，平均cosineФ值為0.63±0.04，并隨電場強度升高而增強，該組細胞各電場強度下移行分布指標(biāo)均高于無血清組(P<0.001)。EGF可增強hRPE細胞對電場作用的反應(yīng)，在同時有血清存在時

15、此作用更為明顯。無血清組培養(yǎng)液中加入EGF后，在4V/cm電場中細胞平均cosineФ值為0.35±0.09，隨電場強度的增高，此定向移行逐漸增強。細胞培養(yǎng)液中同時加入血清和EGF后，hRPE細胞在各電場強度中移行分布指標(biāo)均較無血清組和正常培養(yǎng)液組升高。hRPE細胞移行方向隨電極方向轉(zhuǎn)換而改變，表現(xiàn)為始終朝向電場陰極一側(cè)運動。對細胞增生情況的觀察結(jié)果顯示，電場作用12h后hRPE細胞密度和生長速度均較對照組上升，組間差異顯著(P<0.0

16、5)；流式細胞儀檢測顯示實驗組G0/G1期細胞比例下降，S期和G2/M期細胞比例明顯增多，與對照組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Westernblot結(jié)果表明電場作用下細胞內(nèi)cyclinE的蛋白量較對照組升高。
　　3)免疫熒光染色結(jié)果顯示，正常hRPE細胞內(nèi)F-actin在胞漿成網(wǎng)狀分布；電場作用3h后actin纖維束向細胞周邊聚集，尤其是朝向電場陰極一側(cè)；β1integrin在正常hRPE細胞內(nèi)有弱表達，電場作用3h之后

17、熒光強度明顯升高并集中于細胞朝向電場陰極的一側(cè)。細胞松弛素B預(yù)處理細胞內(nèi)F-actin和β1integrin均形成散在分布于胞漿內(nèi)的點狀沉積物，電場作用后未見有明顯變化。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，電場作用后β1integrin的mRNA和蛋白表達均升高，該現(xiàn)象可被細胞松弛素B抑制。FAK蛋白在hRPE細胞中穩(wěn)定表達，各組間未見顯著性差異。pFAK在未受電場作用的細胞中有微弱表達，電場作用后表達迅速、持續(xù)上升，兩組間差別顯著(P<0.05

18、)。
　　4)PTEN基因被成功轉(zhuǎn)染入hRPE細胞，轉(zhuǎn)染有PTEN的hRPE細胞在電場作用前后細胞形態(tài)和移行均未發(fā)生明顯變化，正常對照組細胞在10V/cm電場作用3h后平均cosineФ值為0.78±0.02，PTEN轉(zhuǎn)染細胞降至0.19±0.02，組間差異顯著(P<0.01)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，PTEN轉(zhuǎn)染后G1期細胞百分比上升，S期和G2/M期細胞數(shù)量下降，與對照組相比差異顯著(P<0.01)；6V/cm電場作用12h后

19、，細胞周期的上述表現(xiàn)無明顯變化(P>0.05)。Westernblot檢測結(jié)果顯示，hRPE細胞中FAK蛋白的總水平在PTEN轉(zhuǎn)染和電場作用前后均無顯著變化；電場作用后細胞pFAK的蛋白量明顯升高，PTEN轉(zhuǎn)染則抑制了該現(xiàn)象，表現(xiàn)為僅有微弱的蛋白表達。
　　【結(jié)論】
　　1)短時間、低于10V/cm的電場作用對hRPE細胞的正?；盍胺至褵o明顯不良影響，保證了進一步體外和在體實驗的安全性。
　　2)電場作用能夠引導(dǎo)hR

20、PE細胞的定向移行，該作用與電場強度、血清和生長因子有關(guān)；一定時間內(nèi)電場作用能夠通過上調(diào)cyclinE的表達促進hRPE細胞的增生。
　　3)電場對hRPE細胞的作用可引起細胞骨架蛋白的聚合反應(yīng)，進而觸發(fā)整合素及整合素相關(guān)信號通路FAK的活化，說明電場作用至少部分的通過整合素及FAK信號通路進行調(diào)節(jié)。
　　4)PTEN轉(zhuǎn)染能夠明顯抑制hRPE細胞在電場作用后的移行、增生能力及FAK信號通路的活化，說明PTEN通過調(diào)節(jié)FAK信