間斷高糖對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞分泌VEGF的影響.pdf

1、目的:隨著人們生活方式的改變及人類壽命的延長,糖尿病的發(fā)病率日益增高,來自《中國2型糖尿病防治指南》2010年版討論稿的數(shù)據(jù)顯示:目前我國糖尿病患者總體發(fā)病率已達9.7％,另有15％的人為糖尿病前期,糖尿病前期人數(shù)達1億4千8百萬以上,高于歐美發(fā)達國家水平,中國目前有超過9240萬的糖尿病患者,已成為全球糖尿病第一大國。未來幾十年內(nèi)糖尿病仍是我國面臨的一個嚴峻的公共衛(wèi)生疾病問題。糖尿病作為一種慢性病,其并發(fā)癥主要分為急性并發(fā)癥和慢性并發(fā)

2、癥兩種,糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)作為糖尿病慢性并發(fā)癥之一,其危害更是不容忽視,可引起視力下降,嚴重者可導(dǎo)致不可逆性視力喪失。目前認為糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生是視網(wǎng)膜組織缺氧及微循環(huán)受損的結(jié)果,其發(fā)展與血糖控制程度及糖尿病病程長短密切相關(guān),病程越長,DR的發(fā)病率越高。目前糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物治療尚不成熟,激光光凝治療是普遍為患者接受的延緩其發(fā)展的治療方法,但其提高視力的作用很弱。為了尋求有效的防治糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的方法,弄清其發(fā)病

3、機制勢在必行。目前的研究認為DR的發(fā)生與糖代謝機制紊亂、多元醇-肌醇代謝通路的異常、非酶性糖基化作用、蛋白激酶C激活、血管舒張性前列腺產(chǎn)物、血流動力學的改變、超氧化物歧化酶活性下降以及視網(wǎng)膜內(nèi)生長因子水平的改變等有關(guān),其中細胞因子的作用尤其是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的作用日益受到關(guān)注。VEGF作為一種細胞生長因子,具有增加血管通透性的作用,被認為是目前所知的最強的內(nèi)皮細胞選擇性促有絲分裂因子和血管生成因子。體內(nèi)多種細胞包括視網(wǎng)膜色素

4、上皮細胞均可分泌VEGF,在正常情況下,視網(wǎng)膜色素上皮細胞可少量分泌VEGF,高糖條件下可促進視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF的分泌,已有研究證實VEGF與DR密切相關(guān)。李才銳等[1]探討了非肥胖糖尿病小鼠血清和視網(wǎng)膜VEGF的表達及二者之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)隨著糖尿病的發(fā)展,糖尿病視網(wǎng)膜病變程度加重,而且血清VEGF含量增高,病程越長,血清中VEGF的含量就越高,揭示了血清VEGF含量和糖尿病病程之間的顯著的相關(guān)性。這一研究結(jié)果與糖尿病病程達10年以上者,

5、糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生率達到50％的研究結(jié)果一致[2]。而且糖尿病患者體內(nèi)的血糖不是一成不變的,它會隨著一些因素的影響而發(fā)生改變。餐后高血糖的控制不佳以及胰島素或促泌劑的不合理應(yīng)用,均可造成糖尿病患者的血糖波動[3]。隨著對高糖毒性研究的日益深入,關(guān)于波動性高糖的研究日益成為熱點。本研究模擬了糖尿病患者體內(nèi)血糖的急性波動狀態(tài),通過比較波動性高糖與恒定性高糖對人視網(wǎng)膜色素上皮(hRPE)細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的影響,從而探討

6、間斷高濃度葡萄糖較恒定性高濃度葡萄糖是否更能促進糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展。
　　 方法:
　　 將體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮(hRPE)細胞分為四組,每組設(shè)有6個復(fù)孔。實驗分組如下:A正常對照組:葡萄糖濃度為5.55mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng);B恒定高濃度葡萄糖組:葡萄糖濃度為25mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng);C間斷高濃度葡萄糖組:葡萄糖濃度為5.55mmol/L與葡萄糖濃度為25mmol/L的兩種條件的DM

7、EM培養(yǎng)液交替培養(yǎng),其中低糖2小時,高糖3小時交替培養(yǎng),以高糖過夜;D高滲對照組:甘露醇濃度為19.4.5mmol/L+葡萄糖濃度為5.55mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。四組分別于24小時,48小時和72小時觀察細胞形態(tài),并收集細胞上清液,-20℃保存待測。按照VEGF試劑盒說明書檢測所收集的上清液中VEGF的含量。
　　 結(jié)果:
　　 1：分組培養(yǎng)24h時
　　 倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)較前無明顯變化,

8、經(jīng)檢驗各組上清液中的VEGF水平無顯著性差異(P＞0.05);
　　 2：分組培養(yǎng)48h時
　　 倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)較前變化不明顯,經(jīng)檢驗各組上清液中的VEGF水平無顯著性差異(P＞0.05);
　　 3：分組培養(yǎng)72h時
　　 與正常對照組(葡萄糖濃度為5.55mmol/L)相比,高滲對照組(甘露醇濃度為19.45mmol/L+葡萄糖濃度為5.55mmol/L的DMEM培養(yǎng)液)細胞在倒置顯微鏡

9、下觀察仍以長梭形或多邊形為主,兩組間VEGF水平亦無顯著性差異(P＞0.05);
　　 與正常對照組(葡萄糖濃度為5.55mmol/L)相比,恒定高濃度葡萄糖組(葡萄糖濃度為25mmol/L)細胞在倒置顯微鏡下觀察可見細胞胞體變薄,形態(tài)不規(guī)則的細胞增多,且經(jīng)檢驗恒定性高濃度葡萄糖組VEGF水平明顯升高,兩組間VEGF水平差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);
　　 與正常對照組(葡萄糖濃度為5.55mmol/L)相比,間

10、斷高濃度葡萄糖組(葡萄糖濃度為5.55mmol/L與葡萄糖濃度為25mmol/L交替)倒置顯微鏡下觀察亦可見細胞胞體變薄,形態(tài)不規(guī)則,且經(jīng)檢測間斷高濃度葡萄糖組VEGF水平明顯升高,兩組間VEGF水平差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);
　　 與恒定高濃度葡萄糖組(葡萄糖濃度為25mmol/L)相比,間斷高濃度葡萄糖組(葡萄糖濃度為5.55mmol/L與葡萄糖濃度為25mmol/L交替)形態(tài)不規(guī)則細胞較多,且VEGF水平明顯升