兔虹膜色素上皮細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞VEGF及其受體FLK-1 mRNA表達的對比研究.pdf

1、目的:虹膜色素上皮(IPE)細胞與視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞具有相同的胚胎發(fā)育來源,基本具備RPE細胞的生理功能,且取材方便,可望替代RPE細胞實現(xiàn)自體移植,治療老年性黃斑變性(ARMD)、視網(wǎng)膜色素變性、黃斑營養(yǎng)不良等疾病.我們采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)對兔眼IPE細胞和RPE細胞VEGF及其受體之一FLK-1 mRNA的表達進行檢測和對比,為IPE細胞代替RPE細胞移植提供理論依據(jù).方法:實驗動物:健康成年有色家兔.I

2、PE細胞和RPE細胞的分離:摘取家兔眼球,無菌操作下沿角膜緣后2mm環(huán)形剪開眼球壁,用0.25﹪胰蛋白酶-0.02﹪EDTA溶液將IPE細胞和RPE細胞分別消化分離下來,收集到eppendorf管內(nèi),立即放入干冰中并于-80℃保存?zhèn)溆?IPE細胞和RPE細胞總RNA的提取:用TRIzol試劑分別提取兩種細胞的總RNA.PCR引物:目的基因為兔VEGF(AC:AB020216)、FLK-1(AC:AB017155),內(nèi)參基因為兔β-act

3、in(AC:AF309819).RT-PCR:RT:應用逆轉(zhuǎn)錄酶AMV將IPE細胞和RPE細胞RNA分別逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA.PCR:以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,以β-actin為內(nèi)參,用PCR擴增各目的基因.PCR產(chǎn)物電泳及定量分析:取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠圖像分析軟件分析并計算目的基因mRNA的相對含量.以上實驗重復四次,所得結(jié)果作兩樣本均數(shù)差異的t檢驗.結(jié)果;RNA樣品鑒定:該實驗所提取的總RNA完整,無明顯降解.RT-PCR產(chǎn)