ILK-siRNA對(duì)缺氧誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞HIF-1α、VEGF表達(dá)及細(xì)胞增殖影響的研究.pdf

1、目的：觀察整合素連接激酶(integrim linked kinase,ILK)在糖尿病鼠視網(wǎng)膜中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及在視網(wǎng)膜新生血管發(fā)展過程中的意義;探討缺氧培養(yǎng)條件下人視網(wǎng)膜色素上皮(Human Retinal Pigment Epithelium,hRPE)細(xì)胞ILK的表達(dá),及其與缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia induciable factor,HIF-1α)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothclial growth

2、factor,VEGF)表達(dá)的相關(guān)性;探討ILK基因特異性的 siRNA干擾對(duì)缺氧培養(yǎng)下的人視網(wǎng)膜色素上皮(hRPE)細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響及其對(duì)缺氧hRPE細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　方法：1)STZ方法建立32只糖尿病(DM)模型鼠,按照喂養(yǎng)時(shí)間隨機(jī)分為DM1m、DM2m、DM3m和DM6M組,8只正常SD大鼠為對(duì)照組。免疫組化方法檢測(cè)糖尿病不同時(shí)期視網(wǎng)膜CD105的表達(dá)用來

3、評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜新生血管的密度;Western blot及RT-PCR方法檢測(cè)各組視網(wǎng)膜ILK的蛋白及mRNA表達(dá),并同對(duì)照組比較。2)人的RPE細(xì)胞培養(yǎng),使用化學(xué)缺氧誘導(dǎo)劑COCL2(150umol/L)模擬缺氧環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞缺氧培養(yǎng)。免疫組化方法檢測(cè)正常培養(yǎng)及缺氧培養(yǎng)6、12、24、48、72小時(shí)人的RPE細(xì)胞中ILK的表達(dá)。使用Western blot方法檢測(cè)以上各缺氧組及對(duì)照組hRPE細(xì)胞ILK、HIF-1α、VEGF的蛋白表達(dá)水平,R

4、T-PCR方法檢測(cè)以上各組hRPE細(xì)胞ILK、HIF-1α及VEGF的mRNA的表達(dá),并以各組mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。3)設(shè)計(jì)合成三條雙鏈ILK小分子干擾RNA(ILK-siRNA)和無關(guān)對(duì)照siRNA,陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ILK的干擾片段抑制缺氧培養(yǎng)24hhRPE細(xì)胞中ILK的表達(dá), RT-PCR方法檢測(cè)三條ILK干擾片段的轉(zhuǎn)染抑制率,選擇ILK-siRNA150nm/L濃度轉(zhuǎn)染hRPE細(xì)胞后缺氧培養(yǎng)24h,Western bl

5、ot和RT-PCR方法半定量檢測(cè)ILK的表達(dá)及其對(duì)HIF-1α、VEGF表達(dá)的影響;MTT法檢測(cè)不同濃度ILK-siRNA1轉(zhuǎn)染hRPE后缺氧培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果：1)CD105在對(duì)照組和DM1m組視網(wǎng)膜組織中不表達(dá),在DM2m組陽性表達(dá)出現(xiàn),DM3m、DM6m組CD105的表達(dá)明顯升高,較相鄰組有顯著差異(P<0.05,P<0.01)。ILK的蛋白及mRNA表達(dá)于正常和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中, ILK蛋白表達(dá)在DM

6、2m組開始顯著升高, ILKmRNA則于DM1m組即開始有顯著的表達(dá)升高,較對(duì)照組有顯著差異(P<0.01)。2) ILK在正常培養(yǎng)hRPE細(xì)胞中有基礎(chǔ)表達(dá),在缺氧培養(yǎng)hRPE細(xì)胞中隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)ILK陽性染色增強(qiáng)。ILK蛋白于缺氧6h開始明顯表達(dá)升高,持續(xù)高表達(dá)至48h,缺氧6h、12h,24h,48h組ILK蛋白表達(dá)較對(duì)照組均有顯著差異(P<0.01);HIF-1α蛋白在正常組中未測(cè)得表達(dá),在缺氧12h組HIF-1α表達(dá)量達(dá)到高

7、峰并持續(xù)高表達(dá)至48h組, VEGF在正常組呈現(xiàn)弱表達(dá),隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)升高,24h達(dá)到最高峰,VEGF蛋白表達(dá)高峰較HIF的表達(dá)高峰延遲一個(gè)時(shí)間點(diǎn)。RT-PCR顯示ILK、HIF-1α、VEGF在正常培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞中均有一定的轉(zhuǎn)錄水平,隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)三者表現(xiàn)了相同的上升趨勢(shì)。相關(guān)分析ILK、HIF-1α,VEGF mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)性(P<0.01)。3)Lipofectamine2000能夠成功介導(dǎo)ILK-siRNA

8、和無關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染hRPE細(xì)胞,轉(zhuǎn)染率>75％,三條雙鏈ILK-siRNA均可有效的抑制ILK的基因表達(dá),抑制率為55.70%-65.82%,選擇50nm/LILK-siRNA1干擾ILK在缺氧24hhRPE細(xì)胞中的表達(dá),ILK蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低了68.98%,HIF-1α,VEGF的蛋白表達(dá)較對(duì)照組分別降低了68.36%、50.60%。ILK的mRNA表達(dá)被顯著抑制,同時(shí)顯著抑制了HIF-1α,VEGF的mRNA表達(dá),較無關(guān)轉(zhuǎn)染組

9、和對(duì)照組均有顯著差異(P<0.01)。10nm/L ILK-siRNA1對(duì)缺氧hRPE細(xì)胞的增殖沒有明顯的影響,在濃度為20-50nm/L范圍ILK-siRNA1呈時(shí)間、濃度依賴性抑制缺氧hRPE細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論：1)ILK在糖尿病視網(wǎng)膜中持續(xù)表達(dá)升高,與CD105的表達(dá)平行,可能參與了糖尿病視網(wǎng)膜新生血管的形成和發(fā)展。2)ILK在缺氧的hRPE細(xì)胞中表達(dá)升高,且與HIF-1α、VEGF的表達(dá)呈相同升高趨勢(shì)。ILK可能與HI