辛伐他汀抑制牛視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的： 增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是指在孔源性視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜復(fù)位手術(shù)后，由于玻璃體腔和視網(wǎng)膜表面廣泛纖維增生膜收縮，最終形成牽拉性視網(wǎng)膜脫離的病變。是裂孔源性視網(wǎng)膜脫離手術(shù)失敗最常見(jiàn)的原因，也是外傷導(dǎo)致視力喪失的重要原因。 PVR 的發(fā)病機(jī)制目前還未完全清楚，但其發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程已經(jīng)明確。PVR作為一個(gè)損傷修復(fù)過(guò)程，其形成過(guò)程可劃分為炎癥期

2、、細(xì)胞增生期和瘢痕期3個(gè)時(shí)期。參與PVR增生的細(xì)胞主要是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigmentepithelium，RPE)和視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其在細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)等刺激因素的作用下，增生、遷移至視網(wǎng)膜表面及玻璃體腔，附著于一切可能的界面，并發(fā)生收縮。RPE細(xì)胞的主要作用為合成膠原及其他細(xì)胞外基質(zhì)，能夠收縮產(chǎn)生牽拉力，從而造成視網(wǎng)膜脫離。所以RPE細(xì)胞在PVR的發(fā)生過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。因此，PVR的藥物治療也多從

3、RPE細(xì)胞入手，通過(guò)抑制RPE細(xì)胞的移行及增生來(lái)達(dá)到治療目的。 辛伐他汀(simvastatin)是一種3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A．HMG-CoA)還原酶抑制藥，目前臨床用于治療高膽固醇血癥，具有良好的治療效果。近年來(lái)，有關(guān)HMG-CoA還原酶抑制藥物的研究日益增多，實(shí)驗(yàn)表明此類(lèi)藥物可抑制多種細(xì)胞增生。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察辛伐他汀對(duì)體外培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜色素上皮

4、細(xì)胞(bovine retinal pigment epithelium，bRPE)增生作用的影響，從而探討一種新的玻璃體視網(wǎng)膜增生性疾病的藥物治療方法。 材料與方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng) 取健康無(wú)眼疾的小牛眼球，小牛處死后立即取眼球，4小時(shí)內(nèi)分離RPE細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)：無(wú)菌條件下，沿角鞏膜緣后5mm處環(huán)形剪開(kāi)眼球壁，棄去眼前節(jié)和玻璃體，用顯微鑷仔細(xì)分離視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層自視盤(pán)處將其剪除，暴露RPE層，用滅菌PBS沖洗眼杯3次，

5、滴加0．25﹪胰蛋白酶溶液，置于37℃孵育箱消化30～60分鐘。取出眼杯，用吸管反復(fù)吹打RPE面使細(xì)胞脫落，收集RPE細(xì)胞懸液，移入無(wú)菌離心管中，加入含20﹪胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液終止消化；以1000r/min離心5min；棄去上清液，加入含20﹪胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液，接種于25ml培養(yǎng)瓶中，置于5﹪C02、飽和濕度的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每3～5天換一次培養(yǎng)液，直至細(xì)胞融合傳代。選第3～6代細(xì)胞用

6、于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞鑒定采用鏈霉親合素-生物素化過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC)法，一抗為鼠抗人細(xì)胞角蛋白單克隆抗體，行免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 2.實(shí)驗(yàn)藥物 辛伐他汀 3.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察RPE細(xì)胞形態(tài)，并照相記錄。 4.RPE細(xì)胞體外藥物敏感試驗(yàn)-MTT試驗(yàn) 選第3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞密度為4～5×10<'4>/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接利?200μl。孵育24h細(xì)胞貼壁

7、后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組單純用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)加入辛伐他汀濃度的不同分為4組(濃度分別為1μmol/L,5μmol/L，10μmol/L，50μmol/L)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h，每孔加入MTT20μl(5mg/ml，)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄去上清液，加入XDMSO 150μl，震蕩均勻，15分鐘后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)A值。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x

8、±s)表示，應(yīng)用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件中One-way ANOVA進(jìn)行檢驗(yàn)。 結(jié)果： 1.RPE細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定原代培養(yǎng)的RPE細(xì)胞呈不規(guī)則形或扁平多角形，可見(jiàn)清晰的透明細(xì)胞核，胞漿內(nèi)富含黑色素顆粒。1～2周后細(xì)胞漸融合，細(xì)胞漿變淡，細(xì)胞呈不規(guī)則形。傳代2～3次后黑色素顆粒顯著減少或消失，細(xì)胞呈梭形及不規(guī)則形。傳代細(xì)胞鋪滿(mǎn)約需3～5天。角蛋白免疫化學(xué)染色胞漿呈特異性棕黃色，呈陽(yáng)性反應(yīng)。 2.辛伐他汀對(duì)細(xì)胞形態(tài)

9、學(xué)的影響倒置顯微鏡下觀察，對(duì)照組可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞少，細(xì)胞呈梭形或多角形，排列均勻。實(shí)驗(yàn)組觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)有隨濃度增加而相對(duì)減少的趨勢(shì)。細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積縮小，懸浮細(xì)胞增多。 3.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同濃度的辛伐他汀作用于RPE細(xì)胞不同時(shí)間后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。MTT法測(cè)得各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組吸光度A值顯示，隨著藥物濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞A值減少，存活率降低。不同作用時(shí)間各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間吸光度比較有統(tǒng)