轉(zhuǎn)bak基因抑制培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生的實驗研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文轉(zhuǎn)bak基因抑制培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生的實驗研究姓名：王靜申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：眼科指導(dǎo)教師：曾水清20040401￥中科技^掌J若I濟(jì)E掌M協(xié)“Em轉(zhuǎn)bak基因抑制培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的實驗研究華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院眼科研究生王靜導(dǎo)師曾水清教授中文摘要目的建立人視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigmentepithelial，RPE)細(xì)胞的原代培養(yǎng)體系并傳代。在陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)下

2、，將bak基因轉(zhuǎn)入人RPE細(xì)胞中，希望通過誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞凋亡來抑制其增殖，為增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的防治提供一種新思路。方法1)采用消化法，從20～35歲意外死亡12小時內(nèi)的供體限中獲取RPE細(xì)胞，以細(xì)胞密度5104／ml接種予50rot培養(yǎng)瓶中，加入含20％新生小牛血清的DMEM／F12，置于370c、飽和濕度、5％C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1—3天換液一次。待原代細(xì)胞鋪滿融合后，按1：2—3傳代。每同倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，取

3、對數(shù)生長期細(xì)胞繪制細(xì)胞生長曲線。傳至第三代時，通過細(xì)胞爬片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞：2)構(gòu)建bak基因的真核表達(dá)載體bak／pcDNA，，在陽離子脂質(zhì)體Dosper介導(dǎo)下將bak／pcDNA3轉(zhuǎn)染至人RPE細(xì)胞，用原位雜交法檢測bak基因在人RPE細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率，用免疫組化法檢測bak蛋白在人PRE細(xì)胞中的表達(dá)：3)免疫組化法檢測bcl一2和bak在轉(zhuǎn)染后人RPE細(xì)胞中的表達(dá)；4)用TUNEL法和流式細(xì)胞儀檢測bak基因誘